倪志濤，季慧，高紅昌，鄭宏，張華杰

（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035）

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素分泌缺陷或生物功能受損而導(dǎo)致的全身代謝性疾病[1]。糖尿病往往會出現(xiàn)涉及全身多個器官的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年增加[2]。早在1922年就發(fā)現(xiàn)了糖尿病能引起認知功能障礙[3]，其表現(xiàn)為智力減退和靈活性降低等[4]。糖尿病腦病作為糖尿病的并發(fā)癥之一會嚴重降低患者的生活質(zhì)量[5]，但是其發(fā)病機制尚不明確。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[6]?；诤舜殴舱翊x組學(xué)技術(shù)能夠系統(tǒng)地分析機體受到疾病干預(yù)情況下代謝物變化[7]，其憑借樣品制備簡單、分析速度快、重現(xiàn)性高等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于腦代謝研究[8]。現(xiàn)階段的腦代謝研究主要集中在與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬組織，而對其他腦區(qū)的關(guān)注較少，因此本研究運用基于核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)分析糖尿病大鼠大腦皮層、紋狀體、下丘腦和中腦等腦區(qū)的代謝變化，為探索糖尿病腦病的潛在代謝機制提供新線索。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與動物 BrukerAVANCEIII600核磁共振譜儀（德國Bruker公司）；冷凍干燥機（ALPHA-4，德國Christ公司）。血糖儀及血糖試紙（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；重水（D2O，99.9%）購于美國劍橋同位素實驗室；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma-Aldrich公司；枸櫞酸、枸櫞酸鈉、甲醇、氯仿購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。雄性SD大鼠20 只，體質(zhì)量180～200g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，室溫（22±2）℃，相對濕度45%±3%，動物許可證號：SYXK（滬）2017-0008。本研究通過實驗動物倫理學(xué)委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 建立1 型糖尿病大鼠模型：雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分成糖尿病組和對照組，每組8只。糖尿病組大鼠禁食12h后分別按體質(zhì)量單次腹腔注射65mg/kg的STZ枸櫞酸鈉混懸液，對照組給予相同體積的枸櫞酸鈉溶液，72h后分別測其空腹血糖水平，以大鼠血糖值大于16.7mmol/L代表造模成功。

1.2.2 大鼠腦組織收集與處理：大鼠經(jīng)造模成功

10周后斷頭處死，迅速分離出大腦皮層、紋狀體、下丘腦和中腦，并將分離出的組織放入液氮中急凍，之后儲存于-80℃。取樣本稱重后置于勻漿管內(nèi)，分別加入冰甲醇4mL/g，蒸餾水0.85mL/g，使用組織勻漿機勻漿后渦旋15s；再分別加入2mL/g冰氯仿和冰蒸餾水，渦漩后于冰上靜置15min[9]。4℃、12000×g離心15min后取上層溶液置于凍干機內(nèi)凍干24h。最后將凍干粉末重新溶解于500μLD2O中，4℃、12000×g 離心10min后將上清液轉(zhuǎn)入NMR樣品管中進行測試。

1.2.31HNMR圖譜采集與分析：使用BrukerAVANCEIII600MHz超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀采集1HNMR圖譜。采用zgpr標準脈沖序列，僅用預(yù)飽和方式壓制水峰。具體參數(shù)如下：采樣標準溫度298K，譜寬12000Hz，數(shù)據(jù)采集點數(shù)64K，弛豫延遲10s，累加次數(shù)256次，每次掃描時間2.65s。采集到的圖譜均采用BrukerTopspin2.1軟件進行相位及基線調(diào)整，并以乳酸甲基峰的化學(xué)位移（1.33ppm）進行定標。將同組樣本導(dǎo)出的數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入到MATLABR2010軟件（美國MathWorks公司）中進行相位調(diào)整，然后對譜峰段（0.5～9.0ppm）以0.01ppm的間隔進行積分切割。為了消除負值和水峰的影響，將各組樣本數(shù)據(jù)中的負值和水峰（4.60～5.20ppm）置零。對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化[10-11]，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0軟件（瑞典Umetrics公司）進行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA），所得譜圖的X軸和Y軸分別代表第一主成分（firstprincipalcomponent，PC1）和第二主成分（secondprincipalcomponent，PC2）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 糖尿病大鼠大腦皮層組織典型1HNMR代謝指紋圖譜

2.1 糖尿病大鼠腦區(qū)代謝模式分析 圖1為大鼠大腦皮層的典型1D1HNMR譜，紋狀體、下丘腦、中腦的譜圖與大腦皮層譜圖極為相似，故不做展示。通過相關(guān)文獻，并結(jié)合NMRSuite7.0軟件和人類代謝數(shù)據(jù)庫（www.hmdb.ca）進行分析鑒定，歸屬出的代謝物有亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、N-乙酰天門冬氨酸、肌酸、膽堿、磷酸膽堿、牛磺酸、甘氨酸、腺苷磷酸、肌苷、富馬酸、天冬氨酸、琥珀酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肌醇。2組大鼠4個腦區(qū)代謝物的PCA分析結(jié)果表明，糖尿病組和對照組大鼠4個腦區(qū)代謝物在PC1方向上均有明顯區(qū)分，代謝模式差異明顯（見圖2）。從相對應(yīng)的載荷圖中可以發(fā)現(xiàn)乳酸、肌酸、谷氨酸、N-乙酰天門冬氨酸等在大腦皮層的代謝模式區(qū)分中貢獻較大。谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、肌醇、?；撬岬仍诩y狀體的代謝模式區(qū)分中貢獻較大。乳酸、肌醇、磷酸膽堿、?；撬帷ⅵ?氨基丁酸等在下丘腦的代謝模式區(qū)分中貢獻較大。另外，乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、磷酸膽堿等在中腦的代謝模式區(qū)分中貢獻較大。

2.2 腦區(qū)代謝物定量分析結(jié)果 對代謝物進行定量分析發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠大腦皮層中乳酸、?；撬?、肌酸、磷酸腺苷、谷氨酸、纈氨酸、天冬氨酸等代謝物含量顯著上升，而甘氨酸、磷酸膽堿、肌醇、富馬酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸等代謝物出現(xiàn)下降（P ＜0.05），見圖3。與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠紋狀體中乳酸、牛磺酸、磷酸膽堿、磷酸腺苷的含量顯著升高，而丙氨酸、甘氨酸、肌酸、膽堿、肌苷、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、N-乙酰天門冬氨酸、γ-氨基丁酸等代謝物出現(xiàn)下降（P＜0.05），見圖4。與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠下丘腦中肌醇、?；撬?、磷酸膽堿含量顯著上升，而膽堿、N-乙酰天門冬氨酸、琥珀酸、亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸等代謝物出現(xiàn)下降（P＜0.05），見圖5。與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠中腦中乳酸、肌醇、磷酸膽堿的含量顯著上升，而丙氨酸、磷酸腺苷、N-乙酰天門冬氨酸、肌醇、琥珀酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、丙氨酸、富馬酸等代謝物出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），見圖6。

3 討論

糖尿病患者出現(xiàn)認知功能損傷的確切機制至今不明，研究人員更多關(guān)注于持續(xù)高血糖造成的神經(jīng)元功能紊亂、氧化應(yīng)激、糖基化終產(chǎn)物產(chǎn)生增多等機制。而本研究從基于1HNMR的代謝組學(xué)角度出發(fā)，分析糖尿病對不同腦區(qū)代謝所帶來的影響，有助于更加深入了解糖尿病腦病的發(fā)病機制。

3.1 糖尿病大鼠腦區(qū)特異性能量代謝紊亂 大腦正常生理活動所需的能量占人體能量總消耗的20%以上，腦病的發(fā)生與腦內(nèi)能量代謝變化也有著密切聯(lián)系[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病大鼠的大腦皮層、紋狀體、中腦三個腦區(qū)中乳酸的含量異常升高。這一結(jié)果與報道[14]的糖尿病大鼠海馬組織乳酸含量異常升高相類似，提示糖尿病大鼠腦內(nèi)會出現(xiàn)廣泛的乳酸代謝異常。腦內(nèi)乳酸由葡萄糖通過無氧酵解的方式生成，其含量的升高通常被認為與線粒體功能受損和丙酮酸氧化能力下降有關(guān)。此外，三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA）中間產(chǎn)物富馬酸、琥珀酸在大腦皮層、下丘腦和中腦中出現(xiàn)不同程度下降，這說明在這三個腦區(qū)中三羧酸循環(huán)活性減弱。所以糖尿病大鼠腦組織出現(xiàn)的糖酵解能力及三羧酸循環(huán)活性變化是引起能量變化的重要原因。

圖2 2組大鼠4個腦區(qū)代謝模式分析的PCA得分圖及其對應(yīng)載荷圖

圖3 糖尿病大鼠大腦皮層的代謝通路分析圖

圖4 糖尿病大鼠紋狀體的代謝通路分析圖

圖5 糖尿病大鼠下丘腦代謝通路分析圖

圖6 糖尿病大鼠中腦的代謝通路分析圖

3.2 糖尿病大鼠腦區(qū)特異性神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂 谷氨酸-谷氨酰胺（Glu-Gln-GABA）循環(huán)維持著神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的神經(jīng)遞質(zhì)平衡[15]。星形膠質(zhì)細胞攝取谷氨酸后，將其轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，隨后將合成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元，作為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和γ-氨基丁酸的主要前體物質(zhì)，繼續(xù)參與神經(jīng)沖動傳遞或其他代謝途徑[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在糖尿病大鼠的大腦皮層中的谷氨酰胺和γ-氨基丁酸的含量出現(xiàn)降低，而在下丘腦、中腦兩個腦區(qū)中，谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸的含量均出現(xiàn)顯著降低，說明神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)被嚴重抑制。在2型糖尿病db/db小鼠的全腦代謝分析中同樣出現(xiàn)了類似變化，這提示神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂無論是在1型還是2型糖尿病腦病中都至關(guān)重要[17]。此外紋狀體中γ-氨基丁酸的含量也出現(xiàn)了顯著降低。抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸作為腦內(nèi)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其含量降低也會嚴重影響正常腦功能。天冬氨酸作為興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)能夠參與到TCA循環(huán)的補給途徑中，我們發(fā)現(xiàn)大腦皮層中γ-氨基丁酸含量降低的同時天冬氨酸的含量卻顯著升高，這一結(jié)果進一步說明了神經(jīng)遞質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂。

3.3 糖尿病大鼠腦區(qū)特異性神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物變化 ?；撬岷图〈级际巧窠?jīng)膠質(zhì)細胞的特征性代謝物[18-19]，普遍認為牛磺酸可反映星形膠質(zhì)細胞的活性。我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的大腦皮層、紋狀體和下丘腦中的牛磺酸含量都出現(xiàn)了顯著提高，提示這三個腦區(qū)的膠質(zhì)細胞出現(xiàn)增生，而膠質(zhì)細胞的增生已被發(fā)現(xiàn)于糖尿病大鼠腦中[20]。此外有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬膠質(zhì)細胞增生與海馬神經(jīng)元的凋亡有著緊密聯(lián)系[21]，因此我們推測上述三個腦區(qū)的神經(jīng)元也出現(xiàn)了不同程度的損傷。同時?；撬嵋簿哂锌寡趸饔?，這提示糖尿病大鼠腦內(nèi)可能出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷。肌醇是調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞滲透壓平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要代謝物。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病大鼠大腦皮層中肌醇含量出現(xiàn)下降，這提示神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能異常，膠質(zhì)細胞滲透壓調(diào)節(jié)能力失效；而下丘腦和中腦卻出現(xiàn)完全相反的結(jié)果，膠質(zhì)細胞的滲透壓調(diào)節(jié)顯著增強。

3.4 糖尿病大鼠腦區(qū)特異性膽堿代謝異常 膽堿和磷酸膽堿是生物膜的重要組成成分，膽堿和磷酸膽堿含量的變化與細胞膜損傷有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在糖尿病大鼠大腦皮層中，磷酸膽堿的含量出現(xiàn)顯著的下降而膽堿含量無明顯變化。這一結(jié)果提示大腦皮層細胞膜的損傷較為嚴重，細胞的更替能力下降。

3.5 糖尿病大鼠腦區(qū)特異性神經(jīng)元標志物變化 N-乙酰天門冬氨酸作為神經(jīng)元活性的特征性代謝物，一般認為其含量的降低可反映神經(jīng)元的損傷[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，N-乙酰天門冬氨酸在糖尿病大鼠的紋狀體、下丘腦和中腦中都出現(xiàn)顯著下降，說明糖尿病對大鼠腦神經(jīng)元造成較大損傷。因此，高血糖所誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是廣泛涉及多個腦區(qū)的，而并不只存在于海馬區(qū)域[24]。

綜上所述，本研究應(yīng)用基于1HNMR的代謝組學(xué)方法分析了1型糖尿病大鼠大腦皮層、紋狀體、下丘腦和中腦四個腦區(qū)的代謝水平變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠出現(xiàn)腦區(qū)特異性代謝紊亂，主要包括能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)代謝和膽堿代謝。