周懷彬，王娟娟，趙建國，洪旭芬，龐一林，李江輝，譚國強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州325035）

研究發(fā)現(xiàn)過量的重金屬銅對所有的生命體都有毒害作用[1]。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，許多含銅污染物被排放到環(huán)境中[2-4]，對人們的生活與健康造成了巨大威脅，因此，監(jiān)測與防治環(huán)境中重金屬銅的污染已不容忽視。檢測銅的傳統(tǒng)方法主要有原子吸收光譜法[5]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]。但這些方法檢測成本高以及操作繁瑣，并且重金屬在環(huán)境中是以多種形態(tài)存在的，因此，通過檢測其總量難以客觀評價環(huán)境中重金屬的生物有效性與毒性效應(yīng)[7]。而微生物報告菌株/全細(xì)胞微生物傳感器能夠有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的上述不足之處[8-9]。因?yàn)榻?jīng)過基因改造的工程菌株能以劑量依賴方式響應(yīng)環(huán)境中特定化學(xué)物或一類化學(xué)物[10]。

本研究利用Red重組系統(tǒng)刪除了3 個銅離子（Cu2+）“外排泵”基因，獲得了對Cu2+高度敏感的E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突變菌株，從而有利于微生物報告菌株富集水環(huán)境樣品中痕量Cu2+，有效提高了報告菌株的檢測靈敏度以及精確度。本研究構(gòu)建的微生物報告菌株可與理化分析法互補(bǔ)分析水環(huán)境中銅的生物有效性及其總量，從而綜合評價水環(huán)境中銅的生物毒性效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料 野生型E.coliMC4100 購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20、NGC-pMD19-T、pBAD-HisB和pET28a，菌種pET-28a/BL21、DH5α、NGC-T/DH5α和BL21均為浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T購自日本TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Ecogene網(wǎng)站提供的目的基因及其啟動子與轉(zhuǎn)錄終止（CopAp、soxS、copA、cueO、cusA）序列及已知的gfpmut2基因序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物（見表1-2），部分引物在基因的5′端或3′端引入酶切位點(diǎn)。

表1 用于構(gòu)建報告基因的引物序列

表2 用于基因敲除和菌落PCR鑒定的引物序列

1.3 主要儀器 Milli-QAdvantageA10超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司），HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），DU-800核酸-蛋白分析儀（美國Beckman公司），電轉(zhuǎn)化儀（美國BIORAD公司），RF-5301熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.4 方法

1.4.1 融合基因的制備與報告載體的構(gòu)建：利用引物CopAp-1和RPG-2，以E.coli基因組作為模板擴(kuò)增出具有融合位點(diǎn)的CopAp基因，利用引物RPG-3和soxSCo，以質(zhì)粒NGC-pMD19-T作為模板擴(kuò)增出具有相應(yīng)融合位點(diǎn)的gfpmut2基因；將2個含有互相重疊位點(diǎn)的CopAp基因和gfpmut基因按照等摩爾的比例加入反應(yīng)體系中作為模板，利用Pyrobest酶和ExTaq酶，以CopAp-1和SoxS-Co為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖1），PCR條件為：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃3min，35 個循環(huán)；72℃10min；25℃5min。

擴(kuò)增產(chǎn)物（CopAp::gfpmut2）經(jīng)電泳檢測、切膠回收、加A反應(yīng)后與pMD-19T載體連接，測序分析正確后再將其連接到表達(dá)載體pET28a上，獲得報告載體CopAp::gfpmut2-pET28a。將報告載體轉(zhuǎn)化DH5α后挑取陽性克隆提取質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，-20℃凍存?zhèn)溆?，同時于-80℃菌種保存。

圖1 采用交叉PCR技術(shù)構(gòu)建檢測Cu2+的報告基因

1.4.2 利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建缺失copA、cueO 和cusA基因的Cu2+敏感菌株：以pKD3為模板，以各自敲除基因的引物PCR擴(kuò)增含F(xiàn)RT位點(diǎn)（FLP重組酶識別位點(diǎn)）的氯霉素抗性基因（見圖2Step1），將其電轉(zhuǎn)化至含pKD46質(zhì)粒的E.coliMC4100中（見圖2Step2）。pKD46/MC4100細(xì)菌感受態(tài)制備時經(jīng)0.02%（m/v）阿拉伯糖誘導(dǎo)，使pKD46質(zhì)粒在菌體內(nèi)表達(dá)Gam、Bet和Exo3種λ噬菌體重組酶，其中Gam重組酶抑制大腸桿菌的RecBCD核酸外切酶V活性，使轉(zhuǎn)入氯霉素基因不被降解[11]，同時在Exo和Bet重組酶輔助下氯霉素基因與3種待敲除基因copA、cueO、cusA的同源臂發(fā)生同源重組，從而置換出3個目的基因（見圖2Step3），獲得到copA::cat/MC4100、cueO::cat/MC4100和cusA::cat/MC41003種突變菌。然后將溫度敏感型質(zhì)粒pCP20（42℃誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)的同時質(zhì)粒也逐漸丟失）[11]轉(zhuǎn)化至上述3種突變株感受態(tài)細(xì)胞中，消除FRT位點(diǎn)間的氯霉素抗性基因（見圖2Step4），分別得到copA、cueO和cusA基因缺失的單突變菌株。

圖2 采用Red重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)

同樣操作，在單基因突變菌的基礎(chǔ)上制備雙基因突變菌及三基因突變菌。經(jīng)PCR鑒定正確后共制備得到以下7種突變菌：單基因突變菌：ΔcopA、ΔcueO 和ΔcusA；雙基因突變菌：ΔcopA-ΔcueO、ΔcopA-ΔcusA 和ΔcueO-ΔcusA；三基因突變菌：ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA。

1.4.3 含報告載體的微生物報告菌株的構(gòu)建：將報告載體CopAp::gfpmut2-pET28a轉(zhuǎn)化至E.ColiMC4100和7種突變菌中，然后對每種細(xì)菌分別進(jìn)行CopAp::gfpmut2目的基因PCR鑒定與突變菌PCR鑒定，確保重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

1.4.4 野生菌和7 種突變菌及其對應(yīng)的微生物報告菌株對Cu2+的敏感性測定：將野生菌株及7種突變菌株過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至新鮮的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)2h左右，用M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基將吸光度稀釋至OD600為0.005后分裝，加入Cu2+溶液，使其終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μmol/L，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)，檢測其10h內(nèi)濁度改變，間隔2h測量各管菌液OD600值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次操作3份平行管。

取8種含報告載體的宿主菌的過夜培養(yǎng)菌以新鮮LB培養(yǎng)基1:50稀釋并擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5左右，分裝，加入等體積不同濃度的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液至各管菌液終濃度分別為1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3mol/L，另加等體積去離子水作為對照，每種濃度各做3份平行管。將菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)2h后，取100μL菌液10 倍稀釋于0.9mLpH8.0Tris-HCl緩沖液中，加入34mg/mL氯霉素1μL（終濃度為34μg/mL），分別測量各管細(xì)菌稀釋液熒光強(qiáng)度及OD600值，并繪制曲線。

1.4.5 報告菌株檢測Cu2+的最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：用移液槍吸取計(jì)算好的CopAp::gfpmut 2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO過夜菌種子液加入到50mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值約為0.02，于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6，然后加入Cu2+溶液，使其終濃度為100μmol/L，另加等體積無菌MilliQH2O作為陰性對照。將菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)4h后分別測量細(xì)胞熒光強(qiáng)度與濁度變化（為了使背景散射和內(nèi)濾效應(yīng)最小化，需要報告菌株的全細(xì)胞懸浮液的OD600≤0.3[12]）。

此外，本研究也摸索了誘導(dǎo)時間對報告菌株檢測不同濃度Cu2+的靈敏度和線性范圍曲線擬合的影響。首先用移液槍吸取計(jì)算好的CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO過夜菌種子液加入到100mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值約為0.02，于37℃、250r/min震蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.5，分裝（0.99mL/管），然后加入10μL不同濃度的Cu2+溶液至各管菌液，使其終濃度分別為10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5mol/L，另加等體積無菌MilliQH2O作為陰性對照。每種濃度各做9個平行管（每次取3個平行管）。將以上菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)2、3、4h后，4000r/min水平離心10min，棄上清液，收獲的菌體重懸于1mLDB中，然后取50μL重懸菌液20倍稀釋于0.95mLDB中，混勻，分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 GFPmut2在微生物報告菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)情況及鑒定：取CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcusAΔcopA-ΔcueO過夜培養(yǎng)菌以1:50擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5左右，分裝，加入等體積不同濃度的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液至各管菌液，使終濃度分別為1.0×10-8、1.0×10-7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3mol/L，另加等體積去離子水作為空白對照。同時取pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO菌液作為陰性對照。將以上菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)3h，收獲細(xì)菌，重懸于pH8.0Tris-HCl緩沖液中拍照。并選取銅濃度最高的誘導(dǎo)樣品，在激發(fā)波長為481nm條件下進(jìn)行490～600nm范圍波長掃描，并用同樣的激發(fā)波長在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.7 微生物報告菌株檢測Cu2+的特異性研究：選擇CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA菌株進(jìn)一步研究其對其它金屬離子的響應(yīng)情況，觀測其是否能被其他金屬離子啟動誘導(dǎo)表達(dá)GFPmut2蛋白。取CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA過夜培養(yǎng)菌以1:50擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5 左右，分裝后以終濃度為100μmol/L的不同二價金屬離子（Mn2+、Co2+、Ba2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Cr2+）37℃誘導(dǎo)3h，分別取40μL菌液15倍稀釋于pH8.0Tris-HCl緩沖液中，測量熒光強(qiáng)度與OD600值。

1.4.8 流式細(xì)胞術(shù)分析報告菌株檢測信號的穩(wěn)定性與可重復(fù)性：用移液槍吸取計(jì)算好的CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA過夜菌種子液加入到20mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值為0.02，加入10μLKana（100mg/mL），37℃、250r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5左右，分裝（0.99mL/管），加入10μL不同濃度的Cu2+溶液至各管菌液，使其終濃度分別為1.0×10-8、1.0×10-7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3mol/L，另加等體積無菌MilliQH2O作為陰性對照。將以上菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)3h后，4000r/min水平離心10min，棄上清液，收獲的菌體用經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾的0.9%氯化鈉溶液（含有終濃度為20μg/mL氯霉素）重懸洗滌2～3次后，根據(jù)其OD600值將菌液濃度大致調(diào)為5×106CFU/mL，并于37℃震蕩孵育15min以獲得濃度均一的菌懸液。然后取1mL樣品移入流式管中。以激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為505～545nm的檢測參數(shù)對樣本進(jìn)行分析測試。儀器設(shè)定為每個樣本檢測10000個細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.9 確定報告菌株CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA 檢測Cu2+的線性范圍：取CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA過夜培養(yǎng)菌以1:50擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5左右，分裝，加入等體積不同濃度的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液至各管菌中，使Cu2+終濃度分別為5.0×10-8、1.0×10-7、2.5×10-7、5.0×10-7、7.5×10-7、1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol/L，另加等體積去離子水作為對照，每種濃度各做3份平行管。將以上菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)3h，取100μL菌液15倍稀釋于1.4mLpH8.0Tris-HCl緩沖液中，加入氯霉素使終濃度為34μg/mL，分別測量各管細(xì)菌稀釋液熒光強(qiáng)度及OD600值，并繪制曲線進(jìn)行曲線擬合。

1.4.10 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：首先配制含MOPS緩沖劑的培養(yǎng)基：1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/LNaCl，先加50mLMilliQH2O，振蕩至完全融解后加MilliQH2O定容至80mL，高壓蒸汽滅菌（121℃、30min），再加入10mL400mmol/L無菌MOPS緩沖液（pH7.2）[13]，混勻。其次從溫州醫(yī)科大學(xué)茶山校區(qū)采集一個生活飲用水樣品，經(jīng)0.22μm的無菌過濾器過濾。并在過濾后的生活飲用水中加入銅單元素標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度分別為0.5和10mg/L，并采用原子吸收光譜法測定兩種水樣中銅含量。最后用移液槍吸取計(jì)算好的CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA過夜菌種子液加入到上述90mL含MOPS緩沖液的LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值約為0.02，37℃、250r/min震蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.5，分裝（0.9mL/管），然后分別加入100μL上述含不同濃度Cu2+的生活飲用水，每種濃度各做3 個平行管。將以上菌液于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)3h后，4000r/min，水平離心10min，棄上清液，收獲的菌體重懸于1mLDB中，然后取50μL重懸菌液20倍稀釋于0.95mLDB中，混勻，分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算樣品中Cu2+的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果

2.1 報告載體CopAp::gfpmut2-pET28a的構(gòu)建 通過PCR擴(kuò)增，得到大小為1500bp產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符；陽性克隆質(zhì)粒用EcoRI和SalI雙酶切鑒定，同樣也能切出1500bp的目的片段，目的片段序列經(jīng)測序分析確證，表明報告載體CopAp::gfpmut2-pET28a構(gòu)建成功（見圖3）。

2.2 copA、cueO和cusA基因缺失的Cu2+敏感菌株的構(gòu)建 以CopA-No和CopA-Co、CueO-No和CueO-Co、CusA-No和CusA-Co為引物，分別對野生型E.ColiMC4100和通過基因敲除得到的7種突變菌進(jìn)行PCR鑒定。如圖4所示，基因敲除后對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段約為1000bp，而未被敲除的菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物均與野生型菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的大小一致。

2.3 野生菌及7種突變菌對Cu2+的敏感性 通過3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定野生型E.coliMC4100以及7 種突變菌株對Cu2+的敏感性，得出8 種E.coli 各自的最小抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）（見表3）。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)10h后，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分耗盡，部分細(xì)菌吸光度有所下降，故以0～8h作為細(xì)菌生長情況的監(jiān)測時段。并且規(guī)定：8h后，使試驗(yàn)管OD600值與對照管OD600值之比不大于10%的最低Cu2+濃度為細(xì)菌的MIC。

圖3 CopAp::gfpmut2-pET28質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖譜

圖4 野生型E.coliMC4100及其7種突變菌株的菌落PCR鑒定圖譜

如表3所示，copA、cueO和cusA基因缺失的突變菌與野生型細(xì)菌相比，對Cu2+的敏感性均有一定程度的增加，其中以ΔcopA、ΔcopA-ΔcusA和ΔcopAΔcueO-ΔcusA對Cu2+最為敏感，其敏感程度均為野生型的64倍。由此推測，CopA在野生型E.coli 耐受Cu2+的機(jī)制中起主導(dǎo)作用。

2.4 鑒定Cu2+對微生物報告菌株細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 以不同濃度的Cu2+誘導(dǎo)CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO菌株熒光蛋白的表達(dá)，肉眼可見細(xì)菌重懸液呈現(xiàn)明亮的綠色（見圖5A），且隨Cu2+濃度升高而顏色加深。其中圖5A中樣品8的發(fā)射光譜結(jié)果顯示在481nm激發(fā)光激發(fā)下在507nm處具有最大吸收峰（見圖5B），這些特征符合GFPmut2蛋白的熒光特征，這也證實(shí)了目的蛋白的表達(dá)；并且激光共聚焦顯微鏡圖譜顯示與10-4mol/LCu2+孵育后的整個報告菌株的菌體呈現(xiàn)亮綠色（見圖5C），更進(jìn)一步驗(yàn)證了Cu2+可以誘導(dǎo)熒光蛋白的表達(dá)。

表3 Cu2+對野生型E.coliMC4100及其7種突變菌株的MIC（μmol/L）

圖5 經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后微生物報告菌株的表征圖譜

2.5 微生物報告菌株檢測水體中Cu2+最佳參數(shù)的優(yōu)化 如圖6A-B所示，當(dāng)初始細(xì)菌濁度在0.4～0.6時，加入100μmol/LCu2+與微生物報告菌株孵育4h后，微生物報告菌株的生長已進(jìn)入平臺期，細(xì)胞熒光信號的累積以及熒光值與細(xì)菌濁度的比值同樣也進(jìn)入平臺期，不再隨菌株濁度的變化而顯著變化。因此，本研究確定Cu2+誘導(dǎo)報告菌株累積熒光信號的最佳起始OD600值為0.5。

如圖6C所示，隨著與Cu2+孵育時間的延長，報告菌株熒光信號的累積與孵育時間呈正相關(guān)。但是孵育4h后，細(xì)胞中累積的相對熒光強(qiáng)度反而有所下降，這可能是由于細(xì)胞進(jìn)入衰退期所致。經(jīng)曲線擬合分析表明在3h時，在10-7至10-5mol/LCu2+濃度范圍內(nèi)，報告菌株CopAp::gfpmut2-soxSCopET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO累積的熒光信號強(qiáng)度與Cu2+濃度呈線性依賴關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99529。因此，本研究選擇3h為報告菌株與Cu2+最佳孵育時間。

此外，本研究也分析了水環(huán)境pH值對報告菌株細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白穩(wěn)定性的影響。如圖6D所示，當(dāng)水環(huán)境pH值小于6時，GFPmut2熒光信號顯著降低，在此pH值區(qū)間范圍內(nèi)，熒光信號強(qiáng)度與pH值大小負(fù)相關(guān)；在pH值為6～8.5范圍內(nèi)，GFPmut2發(fā)射的熒光信號強(qiáng)，且非常穩(wěn)定。因此，本研究采用pH8.0Tris緩沖液重懸菌體后再進(jìn)行熒光信號的檢測。并且規(guī)定加入LB培養(yǎng)基中水環(huán)境樣品的體積不能超過培養(yǎng)基體積的1/50，從而避免水環(huán)境樣品對培養(yǎng)體系pH值和滲透壓的顯著干擾。

2.6 微生物報告菌株CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO 對Cu2+的特異性分析 CopAp::gfpmut2-pET28a/ΔcopA報告菌株與終濃度為100μmol/L的不同二價金屬離子（Mn2+、Co2+、Ba2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Cr2+）孵育3h后，測量各樣品的熒光及OD600值，分別將各金屬離子誘導(dǎo)的熒光/吸光度值與Cu2+誘導(dǎo)后的熒光/吸光度值（定義為100%）的百分比值為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖。如圖7所示，上述10種金屬離子，只有Cu2+能夠誘導(dǎo)報告菌株表達(dá)熒光蛋白，說明本研究構(gòu)建的報告菌株具有很好的Cu2+響應(yīng)特異性。

2.7 對比分析8種微生物報告菌株檢測Cu2+的靈敏性 根據(jù)8種微生物報告菌株對Cu2+的響應(yīng)曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)缺失cueO或cusA，或者同時缺失cueO和cusA基因，對提高報告菌株檢測Cu2+的靈敏性，幾乎沒有顯著性影響。而缺失copA 基因的系列報告菌株對Cu2+的靈敏度顯著增強(qiáng)，尤其以ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO三突變菌株為宿主菌的報告菌株對Cu2+的響應(yīng)能力最強(qiáng)，產(chǎn)生的熒光信號也最強(qiáng)（見圖8）。綜上所述，本研究采用Red重組系統(tǒng)改造野生型E.coli 之后，可以顯著提高報告菌株的檢測性能。

圖6 微生物報告菌株檢測水體中Cu2+最佳參數(shù)的優(yōu)化

圖7 微生物報告菌株CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO對Cu2+的特異性響應(yīng)圖譜

圖8 敲除參與Cu2+外排轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)蟾婢觏憫?yīng)Cu2+效果的影響

2.8 流式細(xì)胞術(shù)分析報告菌株熒光信號的穩(wěn)定性與可重復(fù)性 TOM-PETERSEN等[14]研究表明，將Cu2+感應(yīng)元件CopAp::gfpmut2插入到質(zhì)粒載體中，會存在熒光本底值高和熒光信號不夠穩(wěn)定的缺陷。但是，目前已有文獻(xiàn)報道的檢測Cu2+的微生物報告菌株，檢測元件都是位于質(zhì)粒中[7，15]。因此，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析了基于質(zhì)粒的感應(yīng)元件熒光信號的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。如圖9所示，雖然與不同濃度Cu2+孵育后報告菌株的單細(xì)胞熒光峰圖在左邊低熒光值區(qū)域具有明顯拖尾現(xiàn)象，甚至無熒光細(xì)胞數(shù)明顯增加（見圖9B-C）。但是相對沒有添加外源性Cu2+的陰性對照（見圖9A），隨著Cu2+濃度的增加，熒光值峰圖明顯右移，高熒光值區(qū)域的熒光峰圖離散度明顯變?。ㄒ妶D9B-C）。尤其是圖9D表明即使是獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，報告菌株應(yīng)答微摩爾濃度以上Cu2+產(chǎn)生的熒光信號，具有很好的可重復(fù)性（SD值＜20%）。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)分析報告菌株熒光信號的穩(wěn)定性與可重復(fù)性

2.9 CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA報告菌株檢測Cu2+的線性范圍 以等體積終濃度分別為5.0×10-8、1.0×10-7、2.5×10-7、5.0×10-7、7.5×10-7、1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol/L的Cu2+誘導(dǎo)CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA報告菌株表達(dá)綠色熒光蛋白，測量其熒光強(qiáng)度和吸光度，以Cu2+終濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度/吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合（見圖10），其回歸方程為y=14460+1924.8log（x），相關(guān)系數(shù)R2=0.99477，表明在0.05～2.5μmol/L（0.0032～0.16mg/L）Cu2+濃度范圍內(nèi)，CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA報告菌株產(chǎn)生的熒光信號與Cu2+濃度之間具有很好的線性關(guān)系。參考我國各類國標(biāo)中針對銅的限制表明，CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA報告菌株具備監(jiān)測地表水和地下水環(huán)境中痕量Cu2+的應(yīng)用潛力（見表4）。

2.10 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步評估報告菌株應(yīng)用于環(huán)境水樣的潛力，本研究在生活飲用水（采集于溫州醫(yī)科大學(xué)茶山校區(qū)）中加入已知濃度Cu2+，分別采用微生物報告菌株和原子吸收光譜法進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微生物報告菌株對生活飲用水中0.0496mg/L和0.9634mg/LCu2+的回收率分別為87.90%和104.37%（見表5），而我國針對生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）中銅的限值為1mg/L，針對污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)（GB8978-1996）的一級標(biāo)準(zhǔn)限值為0.4mg/L（見表4）。因此，本研究所述微生物報告菌株的靈敏度完全具備應(yīng)用于監(jiān)測生活飲用水和污水中Cu2+污染的潛力。

圖10 CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA報告菌株檢測Cu2+的線性范圍

表4 我國各類國標(biāo)中針對銅的限制

表5 報告菌株CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA檢測生活飲用水樣品中Cu2+的加標(biāo)回收率

3 討論

在負(fù)責(zé)維持E.coli 體內(nèi)Cu2+穩(wěn)態(tài)的cop操縱子中，由于cusA、copA和cueO3個結(jié)構(gòu)基因?qū)u2+的外排作用，導(dǎo)致E.coli 胞質(zhì)內(nèi)Cu2+濃度不會隨外環(huán)境Cu2+的增加而升高，從而限制了以其為宿主菌的報告菌株的檢測靈敏性，并且也會導(dǎo)致野生型報告菌株對Cu2+耐受，進(jìn)一步降低其檢測靈敏度。為了解決上述問題，本研究首先對野生型E.coli 宿主菌進(jìn)行了基因工程改造：①刪除了E.coli 中負(fù)責(zé)將Cu2+從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外泵出的copA和cusA基因以及負(fù)責(zé)將Cu+氧化為Cu2+，防止外排到周質(zhì)中Cu+再次進(jìn)入胞質(zhì)的cueO基因；②以熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白GFPmut2[16-17]作為報告標(biāo)志基因構(gòu)建融合報告載體。研究結(jié)果表明本研究構(gòu)建的ΔcopAΔcueO-ΔcusA突變菌對Cu2+非常敏感，在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其敏感性是野生型E.coliMC4100 的64 倍（見表3）。雖然相對ΔcopA 單基因缺失菌株，三突變菌株的敏感性并未顯著增加，但是相對E.coliMC4100，ΔcueO-ΔcusA雙突變菌對Cu2+的敏感性提高了4倍。說明在刪除copA基因的基礎(chǔ)上面，進(jìn)一步刪除cueO 和cusA基因是有助于提高報告菌株對Cu2+敏感性的。并且從8種微生物報告菌株對Cu2+的響應(yīng)曲線可以看出（見圖7），相對野生型報告菌株，宿主菌為ΔcueO、ΔcusA和ΔcueO-ΔcusA的報告菌株對Cu2+的敏感性略有提高；而含有copA基因缺失的報告菌株對Cu2+的敏感性顯著增強(qiáng)，該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[15]；尤其是E.coliΔcopA-ΔcueOΔcusA三基因突變菌響應(yīng)Cu2+的熒光信號最強(qiáng)，線性范圍最好，其累積的熒光信號強(qiáng)度為野生型的40倍左右（見圖8）。綜上所述，本研究構(gòu)建的基于E.coliΔcopA-ΔcueO-ΔcusA 三基因突變菌的報告菌株，相對基于野生型E.coliMC4100或者ΔcopA單突變菌株，能夠有效提升CopAp::gfpmut2檢測元件對水溶液中鈉摩爾數(shù)量級Cu2+的響應(yīng)能力。

綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）因具有檢測方便、熒光穩(wěn)定、無毒害、通用性、不需要外源性底物、輔助因子和ATP、易于實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)以及在活細(xì)胞內(nèi)定時定位觀察等優(yōu)點(diǎn)，已成為微生物報告菌株中最常用報告基因之一[18]。本研究所選報告基因?yàn)樵鰪?qiáng)型GFPmut2，它是在野生型GFP中突變3個氨基酸位點(diǎn)（S65A、V68L、S72A）[17]，它不僅具有更強(qiáng)的熒光信號，而且只需日光中的藍(lán)光（481nm）就可以激發(fā)出亮綠色的熒光，這樣不僅可以提高報告菌株的監(jiān)測靈敏度，更重要的是不需要紫外設(shè)備就能通過肉眼觀測菌體顏色變化判斷目標(biāo)檢測物濃度高低，這為野外實(shí)時監(jiān)測帶來很大方便。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后，通過肉眼即可觀察到報告菌株菌體呈亮綠色，且具有濃度依賴性（見圖5A）。

目前，已有多種基于cop操縱子的Cu2+檢測元件被文獻(xiàn)報道，比如copAp::luxCDABE（檢測Cu2+的線性范圍為3～30μmol/L）[19]，pSLcueR/copAp::luxCDABE（對Cu2+的最低檢出限值（limitofdetection，LOD）為0.15μmol/L）[23]，pSL-cueR/copAp::PpyWT（LOD：0.15μmol/LCu2+）[21]和pPROBEcueR/cueAp::gfp感應(yīng)元件（檢測Cu2+范圍為1～70mg/L）[7]，這些感應(yīng)元件都被插入到質(zhì)粒載體中，然后再轉(zhuǎn)化到野生型E.coli 或者惡臭假單胞菌中，從而構(gòu)建特異性檢測水體中生物有效性Cu2+的全細(xì)胞微生物報告菌株。此外，KANG等[15]最新研究表明，在E.coliΔcopAΔcueR 雙突變菌中共表達(dá)pCopAp-eGFP和pCDF-Duet-CueR質(zhì)粒，可以顯著提高報告菌株檢測Cu2+的敏感性，其檢測Cu2+范圍為0～10μmol/L。本研究基于E.coliΔcopA-ΔcueOΔcusA三基因突變菌構(gòu)建的報告菌株檢測Cu2+的線性范圍為0.05～2.5μmol/L（0.0032～0.16mg/L），相對上述文獻(xiàn)報道的同類微生物報告菌株，其檢測靈敏度具有明顯的優(yōu)勢。

此外，由于環(huán)境樣品成分復(fù)雜，可能會影響報告菌株的生長和GFPmut2蛋白的表達(dá)。比如，固體顆?；驑悠奉伾赡軙鰪?qiáng)/猝滅報告菌株GFPmut2蛋白熒光，有毒物質(zhì)（比如有機(jī)磷殺蟲劑或各類除草劑）的抑制效應(yīng)或營養(yǎng)物質(zhì)的促進(jìn)效應(yīng)[22]。因此，本課題組在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要構(gòu)建組成性表達(dá)GFPmut2的內(nèi)參菌株[20，23]，以校正上述因素對報告菌株熒光表達(dá)的影響。在每次實(shí)驗(yàn)中，將同時使用報告菌株和內(nèi)參菌株對環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。內(nèi)參菌株被用來確定校正系數(shù)[20]。

綜上所述，本研究構(gòu)建的突變菌有很好的線性范圍，跟同類報告菌株相比具有更高的靈敏度。同時采用增強(qiáng)型GFP作為報告基因，能通過肉眼就能觀測菌體顏色的變化，從而判斷目標(biāo)檢測物濃度的高低，具有實(shí)時監(jiān)測的優(yōu)勢。當(dāng)然我們今后將繼續(xù)對報告菌株CopAp::gfpmut2-pET28/ΔcopA-ΔcueOΔcusA進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化，并將其構(gòu)建為能夠檢測水體中Cu2+的微生物傳感器，制定標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程，并應(yīng)用于水體環(huán)境中Cu2+的檢測與監(jiān)測。為進(jìn)一步研發(fā)能夠?qū)崟r、同步、快速檢測多種重金屬污染物（包括鉻、鉛、汞、銅等）的微生物芯片傳感器提供技術(shù)上的借鑒和良好的應(yīng)用范例。