竇曉青，溫明曉，朱迎萍，張淑珍，徐獻(xiàn)麗，許江燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310000，1.婦產(chǎn)科；2.檢驗科）

宮頸癌是發(fā)展中國家女性癌癥第三大死亡原因[1]。雖然治療宮頸癌的手術(shù)、腫瘤免疫治療等多種方法已取得初步成果，但仍有部分患者存在復(fù)發(fā)風(fēng)險，這與癌組織局部的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。在宮頸癌的腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞占所有細(xì)胞比例高達(dá)30%～50%，預(yù)示其對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵作用[2]。根據(jù)巨噬細(xì)胞表型可將其分為M1及M2型，其中M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺傷細(xì)胞內(nèi)病原體、破壞腫瘤、促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)的作用；而M2型巨噬細(xì)胞可通過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、程序性死亡配體1等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與癌癥不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中浸潤的巨噬細(xì)胞以M2型為主，且宮頸癌可通過分泌IL-4、IL-10來促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化[3]，但這些細(xì)胞因子是否在誘導(dǎo)或維持M2巨噬細(xì)胞表型中發(fā)揮重要作用尚未明確。為此，本研究探討宮頸癌細(xì)胞系（HeLa）培養(yǎng)上清液是否可誘導(dǎo)并維持THP-1巨噬細(xì)胞M2表型，以明確HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對THP-1巨噬細(xì)胞分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 流式抗體CD206-FITC、CD163-FITC、HLA-DR-APC、STAT1-PE、pSTAT1-PE、STAT6-PE和pSTAT6-PE購自美國BioLegend公司；IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 細(xì)胞因子檢測試劑盒購于深圳達(dá)科為公司；HumanGrowthFactorPanelMulti-analyteFlowAssay試劑盒購自美國BioLegend公司；硝酸全氮/亞硝酸鹽比色法試劑盒購自美國R&D公司?？筽STAT6抗體購于美國BioLegend公司。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集及細(xì)胞因子檢測：將HeLa細(xì)胞系以1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)體系為DMEM的完全培養(yǎng)基（含10%的FBS，1%的雙抗）。細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時，收集細(xì)胞并離心收集上清液，分裝后凍存于-80℃冰箱。使用深圳達(dá)科為公司的細(xì)胞因子檢測試劑盒和美國BioLegend公司的HumanGrowthFactorPanelMulti-analyteFlowAssay試劑盒測定細(xì)胞因子和生長因子，操作按說明書進(jìn)行。

1.2.2 實驗分組及處理：實驗分組：空白對照組（Mθ組）、M2細(xì)胞誘導(dǎo)組（M2組）、HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理組（Mθ+sHeLa組）。THP-1細(xì)胞系以1×106個/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)體系為RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%的FBS，1%的雙抗）。待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集THP-1并用無菌PBS洗滌3遍后進(jìn)行如下處理。Mθ組：不做刺激處理的基礎(chǔ)狀態(tài)；M2組：20ng/mLIL-4、20ng/mLIL-10 處理3d；Mθ+sHeLa組：加入50%HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理培養(yǎng)3d。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞CD163、CD206和HLA-DR的表達(dá)：離心收集1.2.2中的巨噬細(xì)胞并用PBS洗滌3 次，加入Fc受體阻斷劑于37℃封閉阻斷人Fc受體30min；PBS洗滌3次后，加入CD163-FITC、CD206-FITC或HLA-DR-APC抗體1mL，4℃孵育30min，PBS洗滌3次后，調(diào)整終體積至300mL，流式儀上機檢測。

1.2.4 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、生長因子、TGF-β3水平檢測：用HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理THP-1巨噬細(xì)胞3d后，500r/min離心收集細(xì)胞上清液。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子和血管生成素-2（angiopoietin-2，ANG-2）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）、VEGF。利用Bio-PlexProTMTGF-β3-Plex試劑盒分析TGF-β3的產(chǎn)生。細(xì)胞因子、生長因子和TGF-β3濃度以pg/mL表示，以上操作均按說明書進(jìn)行。

1.2.5 去除HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液48h后THP-1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生生長因子能力變化：為評估在去除HeLa細(xì)胞上清液后，巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及生長因子情況。先用HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理THP-1巨噬細(xì)胞3d，隨后用新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基替換HeLa細(xì)胞上清液后繼續(xù)培養(yǎng)48h。最后，500r/min離心收集細(xì)胞上清液并檢測細(xì)胞因子、生長因子、TGF-β3的濃度。

1.2.6 JAK-STAT6信號通路影響HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對THP-1的分化效果：離心收集并用PBS洗滌各組處理3d后的巨噬細(xì)胞，用破膜固定液于冰上處理細(xì)胞20min，隨后用BD染色緩沖液洗滌細(xì)胞3次，最后加入STAT6-PE或pSTAT6-PE抗體1μL，4℃避光孵育30min。用PBS洗滌并重懸細(xì)胞后上機檢測。使用FlowJo對結(jié)果進(jìn)行分析，以平均熒光強度（meanfluorescenceintensity，MFI）展示實驗結(jié)果。提取THP-1細(xì)胞蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入pSTAT6 一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，滴加ECL發(fā)光，顯影，使用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

圖1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子（A）及生長因子（B）的檢測

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用表示，多組比較采用單因素方差分析，采用Student’st 檢驗分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HeLa細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子 HeLa細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如圖1所示，HeLa分泌的代表性細(xì)胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）及生長因子（ANG-2、HGF、VEGF）表達(dá)的水平。在細(xì)胞因子方面，HeLa細(xì)胞分泌IL-6較多；在生長因子方面，則以HGF、VEGF含量較多。見圖1。

2.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對巨噬細(xì)胞表面受體和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響 為探討HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對巨噬細(xì)胞極化的影響，用HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理巨噬細(xì)胞3d后，收集細(xì)胞分析M1和M2表型表面受體的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。與Mθ組比，M2組及Mθ+sHeLa組的M1型細(xì)胞極化相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記物（HLA-DR）表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而M2型細(xì)胞極化相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD163和CD206）含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理的THP-1巨噬細(xì)胞膜受體HLA-DR、CD163和CD206的檢測

2.3 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、生長因子水平 為探討HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、生長因子的影響，用HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理巨噬細(xì)胞3d，流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子，收集細(xì)胞上清液檢測生長因子水平，結(jié)果見圖3。與Mθ組比，M2組及Mθ+sHeLa組細(xì)胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Mθ組比，M2組及Mθ+sHeLa組的HGF、ANG-2和VEGF明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Mθ組比，M2組及Mθ+sHeLa組的TGF-β3分泌增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的THP-1巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、生長因子、TGF-β3水平的檢測

2.4 去除HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液48h后巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子、生長因子及TGF-β3水平 與Mθ組比，去除HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液48h的巨噬細(xì)胞（Mθ+sHeLasHeLa組）分泌IL-4、IL-6、IL-10、Ang-2、HGF、VEGF濃度增加（P＜0.05）；同時，與Mθ組比，Mθ+sHeLa-sHeLa組TGF-β3增加（P＜0.05），見圖4。

圖4 去除HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液48h后THP-1巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子、生長因子、TGF-β3蛋白水平

2.5 JAK-STAT6信號通路參與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液對M2型巨噬細(xì)胞的分化 M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（STAT6、pSTAT6）表達(dá)如圖5所示，與Mθ組比，Mθ+sHeLa組的巨噬細(xì)胞pSTAT6表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液可通過激活JAK-STAT6信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。

3 討論

浸潤腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞通常稱為腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞，其對腫瘤的發(fā)展起重要作用。巨噬細(xì)胞可在不同條件的誘導(dǎo)下向M1或M2極化，其中M2表型巨噬細(xì)胞參與促進(jìn)Th2免疫反應(yīng)，并通過表達(dá)VEGF、TGF-β、吲哚胺2，3-雙加氧酶、程序性死亡配體1促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，且M2巨噬細(xì)胞的存在與不良預(yù)后有關(guān)[2]。本研究初步分析宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液相關(guān)生長及細(xì)胞因子水平，并探討其對于巨噬細(xì)胞極化的影響。

腫瘤細(xì)胞所釋放的細(xì)胞產(chǎn)物一方面促進(jìn)血管生成、新陳代謝、腫瘤相關(guān)細(xì)胞募集和腫瘤增長[5-6]；另一方面，它們也可誘導(dǎo)M2表型巨噬細(xì)胞，在維持免疫抑制微環(huán)境、促進(jìn)血管生成和代謝方面發(fā)揮重要作用[7]。胃癌細(xì)胞通過釋放的IL-4、IL-10、單核細(xì)胞集落刺激因子引起腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociatedmacrophages，TAMs）向M2表型極化[8]。本研究發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有高濃度的IL-6、IL-4、HGF、VEGF。細(xì)胞因子IL-6、IL-4被認(rèn)為參與單核細(xì)胞分化成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的過程中，同時也是誘導(dǎo)M2表型巨噬細(xì)胞的重要因子[9]；VEGF和HGF一樣具有較強的促血管生成作用，共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[10]。這表明，HeLa細(xì)胞上清液也一方面可通過釋放IL-6、IL-4 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)TAMs向M2表型極化，另一方面也可通過釋放HGF、VEGF可通過促進(jìn)血管生成、新陳代謝、腫瘤相關(guān)細(xì)胞募集和腫瘤生長。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)及Westernblot檢測巨噬細(xì)胞中pSTAT6水平

在本研究中，經(jīng)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的CD163、CD206表達(dá)上調(diào)，說明HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2細(xì)胞極化。同時，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的巨噬細(xì)胞可釋放大量ANG-2、HGF、VEGF。ANG-2作為M2表型的巨噬細(xì)胞分泌的代表性生長因子，可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長作用，它與HGF、VEGF一道通過不同方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。重要的是，在去除Hela細(xì)胞培養(yǎng)基48h后，巨噬細(xì)胞可持續(xù)高表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10以及ANG-2、VEGF、HGF，這預(yù)示在切除腫瘤后，受到原先腫瘤局部微環(huán)境影響的M2型巨噬細(xì)胞可繼續(xù)分泌相關(guān)細(xì)胞因子及生長因子來促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)。既往研究顯示TGF-β3 的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，并且M2型巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β3也可通過自分泌的形式作用于自身，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化[7]。在黑色素瘤與乳腺癌中，TGF-β3 的高表達(dá)與病情加重及不良預(yù)后有關(guān)[11]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的巨噬細(xì)胞釋放TGF-β3水平升高，也提示其在宮頸癌中的重要作用。

JAK/STAT信號通路與由各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的各種生物學(xué)應(yīng)答有關(guān)，在非受體型JAK的作用下，轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化并發(fā)生二聚化，磷酸化的STAT轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，激活相關(guān)基因表達(dá)；轉(zhuǎn)錄因子STAT分為多種亞型，其中STAT6與M2相關(guān)特異性基因表達(dá)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)IL-4等細(xì)胞因子可通過激活JAK/STAT6途徑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2的極化[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理后的巨噬細(xì)胞中磷酸化STAT6水平增加。由于HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液存在IL-4等多種細(xì)胞因子，因此可以推測HeLa細(xì)胞是通過釋放相關(guān)細(xì)胞因子來激活JAK/STAT6途徑，進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2極化。

本研究也存在不足，首先本研究采用Hela細(xì)胞系，和真實腫瘤細(xì)胞存在差異；其次，HeLa細(xì)胞系及巨噬細(xì)胞可分泌諸多細(xì)胞產(chǎn)物，而本研究僅檢測少數(shù)幾種與M2巨噬細(xì)胞極化有關(guān)的細(xì)胞因子及生長因子，其余細(xì)胞產(chǎn)物的作用還需后續(xù)深入研究。

綜上所述，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型的極化，參與腫瘤的生長和血管生成。