王靚，董思思，陳婧，吳笑英，阮璐雅，潘優(yōu)津，胡云良，鄭超

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，浙江溫州325027；2.臨沂市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東臨沂276000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江溫州325027）

1，25-二羥維生素D3[1, 25(OH)2D3]作為維生素D最重要的活化形式，通過(guò)與體內(nèi)一種特異性核受體，即VitD受體（VDR）結(jié)合而起作用。研究表明，1, 25(OH)2D3能調(diào)控體內(nèi)鈣磷代謝以維護(hù)骨健康，低血清1, 25(OH)2D3水平與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病（包括高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、缺血性心臟病、心力衰竭）的風(fēng)險(xiǎn)增加和胰島素抵抗相關(guān)[1-4]。但目前鮮見(jiàn)1, 25(OH)2D3對(duì)軟脂酸（palmiticacid，PA）所誘導(dǎo)的胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙作用的機(jī)制研究。本研究探討1, 25(OH)2D3是否通過(guò)激活胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞的Akt/eNOS信號(hào)通路促進(jìn)產(chǎn)生NO，影響內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）的表達(dá)，從而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。骨化三醇注射液購(gòu)于德國(guó)APPPharmaceuticals公司，棕櫚酸及BSA（FAFBSA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。兔peNOS（Ser1177）抗體購(gòu)于美國(guó)CellSignaling公司，鼠pAkt（Ser473）抗體、鼠單克隆GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)BioworldTechnology公司。CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京普利萊公司，硝酸鹽/亞硝酸鹽熒光檢測(cè)用試劑盒購(gòu)于美國(guó)Cayman公司，ET-1以及VDR引物購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 儀器：熒光顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀、二氧化碳孵箱、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴箱、LightCycle480分析儀、冷凍離心機(jī)、PCR儀、MiniVE垂直電泳系統(tǒng)、倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 分組：將HUVECs設(shè)置為對(duì)照組、PA組、VD組。其中對(duì)照組為僅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的未干預(yù)HUVECs。PA組為最佳濃度0.6mmol/LPA誘導(dǎo)的HUVECs，即胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。VD組為最佳濃度1nmol/L1, 25(OH)2D3干預(yù)后的上述胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，據(jù)干預(yù)時(shí)間分為VD0.5h組、VD1h組、VD2h組、VD4h組、VD8h組、VD16h組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：HUVECs培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）中，并置于含5%CO2，相對(duì)濕度為95%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立：HUVECs細(xì)胞接種到96孔板中（每孔的體積為100μL），培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中。待貼壁穩(wěn)定生長(zhǎng)后，加入不同濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mmol/L）的PA培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18h。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：每孔加CCK-8溶液繼續(xù)孵育1.5h，測(cè)定各孔450nm處的OD值。對(duì)照組只加CCK-8溶液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)基中葡萄糖含量的檢測(cè)：蒸餾水稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（10mmol/L），分別為125、250、500、1000μmol/L。按照空白管（蒸餾水5μL+工作溶液195μL）、標(biāo)準(zhǔn)管（標(biāo)準(zhǔn)品5μL+工作溶液195μL）、測(cè)定管（樣本5μL+工作溶液195μL）加樣。孵育37℃20min之后測(cè)定570nm處的OD值。計(jì)算各樣品的葡萄糖濃度。用各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量反映胰島素抵抗的程度。據(jù)測(cè)得的相對(duì)細(xì)胞增殖活力及葡萄糖消耗量確定最佳PA濃度培養(yǎng)的胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的PA組。

1.2.4 Westernblot法測(cè)定pAkt及peNOS蛋白表達(dá)：最佳PA濃度培養(yǎng)的胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型（PA組），加入含0.01、0.1、1、10、100nmol/L1, 25(OH)2D3作用1h，隨后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定相應(yīng)的蛋白濃度。用樣品緩沖液配平蛋白樣品，煮沸法使蛋白變性。SDS-PAGE膠電泳分離不同分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST室溫下?lián)u床封閉2h，加入兔peNOS、pAkt抗體作為特異性一抗，室溫孵育2h，TBST洗膜后以相應(yīng)的抗兔或抗鼠IgG作為二抗室溫?fù)u床孵育2h，TBST洗膜后曝光顯影，對(duì)目的條帶進(jìn)行半定量分析，測(cè)得pAkt及peNOS蛋白的表達(dá)量，據(jù)結(jié)果確定1, 25(OH)2D3最佳干預(yù)濃度。

1.2.5 NO分泌的檢測(cè)：最佳濃度1, 25(OH)2D3干預(yù)細(xì)胞模型不同時(shí)間（15、30、60、120、240、480s），根據(jù)NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)對(duì)照組、PA組、VD組NO濃度。將硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋?zhuān)凑湛瞻卓祝ㄏ跛猁}分析緩沖液80μL），標(biāo)準(zhǔn)孔（緩沖液30μL+標(biāo)準(zhǔn)品50μL），待測(cè)樣品孔（緩沖液60μL+樣品20μL）加樣，之后每個(gè)孔依次加入10μL硝酸還原酶的輔因子和10μL硝酸鹽還原酶。加入10μLDAN試劑后繼續(xù)孵育10min，加入20μLNaOH，測(cè)量各孔熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm），根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)際濃度，獲得各時(shí)段NO濃度。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ET-1mRNA、VDRmRNA的相對(duì)表達(dá)量：1nmol/L1, 25(OH)2D3干預(yù)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞，分別于0.5、1、2、4、8、16h時(shí)檢測(cè)。①總RNA提取，棄去培養(yǎng)基后，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞，加入1mLTRIzol冰上充分裂解后轉(zhuǎn)移至去酶的EP管。加入0.2mL氯仿，振蕩、冰上靜置，4℃12000r/min離心15min，吸取無(wú)色上清液移入去酶EP管，加入等量異丙醇，顛倒混勻、冰上靜置，4℃12000r/min離心10min。去除異丙醇上清液，加入75%乙醇1mL，顛倒混勻，4℃7500r/min離心5min重復(fù)2 次，棄去上清液，通風(fēng)干燥5～10min待乙醇揮發(fā)，加入30μLDEPC水使沉淀完全溶解，測(cè)定RNA的濃度。②嚴(yán)格按照二步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。③Real-TimePCR反應(yīng)，模板cDNA2μL，SYBRGreen10μL，滅菌蒸餾水6μL，上、下游引物各1μL混勻，注意避免氣泡產(chǎn)生，按照91℃1min，94℃40s，65℃40s，72℃1min，72℃1min，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算出相應(yīng)mRNA的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間的比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA干預(yù)HUVECs后細(xì)胞活力下降，細(xì)胞外葡萄糖消耗減少 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在PA濃度為0.4～0.9mmol/L時(shí)，HUVECs活力逐漸下降，并且呈濃度梯度依賴性（見(jiàn)圖1）。與對(duì)照組相比，PA（0.3～0.9mmol/L）處理后，HUVECs細(xì)胞外的葡萄糖消耗量顯著降低，并且在PA濃度為0.6mmol/L時(shí)，葡萄糖消耗量最少（見(jiàn)圖2）。結(jié)合細(xì)胞增殖活性以及葡萄糖消耗量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選定PA濃度為0.6mmol/L建立胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。

圖1 不同濃度PA作用的HUVECs相對(duì)細(xì)胞增殖活力

圖2 不同濃度PA作用的HUVECs細(xì)胞外葡萄糖消耗量

2.2 1, 25(OH)2D3能夠增加胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞peNOS、pAkt的蛋白表達(dá)水平 如圖3-4所示，0.01、0.1、1、10、100nmol/L1, 25(OH)2D3分別干預(yù)胰島素抵抗細(xì)胞模型（即最佳濃度0.6mmol/LPA處理后的細(xì)胞模型）1h后，Westernblot結(jié)果顯示peNOS、pAkt的蛋白表達(dá)量增加，并且在1nmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（P ＜0.05）。提示1nmol/L1, 25(OH)2D3可以上調(diào)peNOS、pAkt蛋白水平的表達(dá)，激活A(yù)kt/eNOS通路。

2.3 1, 25(OH)2D3逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO含量下降 如圖5所示，1nmol/L1, 25(OH)2D3刺激胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生，隨著1, 25(OH)2D3作用時(shí)間延長(zhǎng)，NO濃度升高，在60s時(shí)濃度最高，與PA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但是隨著作用時(shí)間進(jìn)一步增加，NO濃度迅速下降，在120s時(shí)達(dá)到最低后逐漸輕度上升。

圖3 不同濃度1, 25(OH)2D3干預(yù)的胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型peNOS相對(duì)表達(dá)量

圖4 不同濃度1, 25(OH)2D3干預(yù)的胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞模型pAkt相對(duì)表達(dá)量

圖5 1nmol/L1, 25(OH)2D3干預(yù)后VD組NO濃度

如圖6所示，PA組較對(duì)照組細(xì)胞NO濃度下降（P＜0.01），1, 25(OH)2D3干預(yù)60s后NO濃度顯著增加，與PA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 1, 25(OH)2D3減少胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1和VDRmRNA相對(duì)表達(dá)量 如圖7所示，PA組ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。VD組ET-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量較PA組顯著下降（P＜0.01），隨著VD干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。1, 25(OH)2D3處理后，與PA組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的VDRmRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖8）。

圖6 對(duì)照組、PA組、VD組NO濃度比較

圖7 對(duì)照組、PA組、VD不同時(shí)間組ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖8 對(duì)照組、PA組、VD不同時(shí)間組VDRmRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

胰島素所調(diào)控的微血管開(kāi)放功能障礙是早期胰島素抵抗的重要病理機(jī)制之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖的2型糖尿病患者往往在病程初期階段存在骨骼肌中微血管開(kāi)放總面積的下降[2]。微血管開(kāi)放功能主要與各組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞的舒張功能有關(guān)。胰島素可以調(diào)控血管的舒張，這與調(diào)節(jié)NO的釋放有關(guān)。胰島素抵抗的肥胖個(gè)體通常伴有血管內(nèi)皮舒張功能的受損。已有研究證明，1, 25(OH)2D3可通過(guò)鈣離子內(nèi)流影響內(nèi)皮細(xì)胞的收縮[3]。內(nèi)皮細(xì)胞存在有VDR，與維生素D相結(jié)合后可激活調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)中的反應(yīng)元件因子（vegf）啟動(dòng)子并影響鈣離子內(nèi)流[4]。MOLINARI等[5]發(fā)現(xiàn)VDR與1, 25(OH)2D3相互作用可引起Akt、ERK和P38的磷酸化，從而活化eNOS，使內(nèi)皮細(xì)胞NO量顯著增加。但1, 25(OH)2D3對(duì)胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)制尚不明確。本研究觀察到1nmol/L1, 25(OH)2D3刺激胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生，隨著1, 25(OH)2D3作用時(shí)間延長(zhǎng)，NO濃度升高，在60s時(shí)濃度最高。我們的研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果有一致性，1, 25(OH)2D3不僅促進(jìn)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，同時(shí)對(duì)PA誘導(dǎo)的功能受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞也有相同的作用，這可能是一個(gè)潛在的維生素D改善血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制。

維生素D改善血管內(nèi)皮功能可能的機(jī)制與激活PI3K-Akt-eNOS通路和下調(diào)ET-1有關(guān)。ALVAREZ等[6]發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損、NO水平下降以及氧化應(yīng)激增強(qiáng)。游離脂肪酸誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與eNOS和Akt磷酸化水平降低以及caspase-9的活性增強(qiáng)相關(guān)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者采用棕櫚酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從細(xì)胞層面上觀察黃芪多糖對(duì)AMPK、Akt、eNOS及Nox4蛋白活性表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響，探索其改善血管內(nèi)皮功能障礙、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能機(jī)制[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在0.4～0.9mmol/L范圍內(nèi)，PA可抑制HUVECs活力，并呈濃度依賴性。研究還發(fā)現(xiàn)，PA組與對(duì)照組比較，NO濃度下降，而1nmmol/L的1, 25(OH)2D3能夠上調(diào)eNOS和Akt的磷酸化水平，增加NO產(chǎn)生，從而改善PA誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。

ET-1是最強(qiáng)效的內(nèi)源性血管收縮劑之一。有研究表明，2型糖尿病患者微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ET-1表達(dá)量較正常人有所增加[8]。游離脂肪酸能夠增強(qiáng)胰島素誘導(dǎo)的ET-1的釋放[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，PA組血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1mRNA表達(dá)顯著增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而1nmmol/L的1, 25(OH)2D3干預(yù)后，ET-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量較PA組顯著下降，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，VD干預(yù)各組與PA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此推測(cè)1, 25(OH)2D3降低PA誘導(dǎo)的ET-1mRNA的表達(dá)可能是改善內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的因素之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，1, 25(OH)2D3作用后VDRmRNA的表達(dá)與PA干預(yù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)?, 25(OH)2D3激活PI3K/Akt/eNOS通路，并不影響VDR的數(shù)量。

綜上所述，本研究通過(guò)建立PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，用不同濃度1, 25(OH)2D3干預(yù)，發(fā)現(xiàn)1nmol/L1, 25(OH)2D3可以增加peNOS、pAkt蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，并且下調(diào)ET-1mRNA的表達(dá)，從而改善PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。