王嵐玉，馬煜，張潔，張國(guó)志，陳建立

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 唐山)

0 引言

微小RNA(miRNA)是一種進(jìn)化上保守的內(nèi)源性的小非編碼RNA，主要通過(guò)靶向結(jié)合3’-UTR，調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性和蛋白的翻譯來(lái)發(fā)揮作用[1]。在過(guò)去的十幾年里，很多體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]，有些miRNA 已被提出作為癌癥治療的新型潛在靶標(biāo)[3]。目前為止，有研究表明miR-449a 在多種腫瘤中呈現(xiàn)較低表達(dá)，包括肝癌、胃癌等，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-449a 在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)和敲低miR-449a 對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，并研究此過(guò)程細(xì)胞中一些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-449a mimics 和mimics NC，miR-449a Inhibitor 和Inhibitor NC(銳博公司)；人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460 以及人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞LOVO；胎牛血清；RPMI-1640 培養(yǎng)基；磷酸緩沖鹽溶液；trizol；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；PCR 引物、miRNAqPCR Kit；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒；Bradford 蛋白測(cè)定試劑(碧云天生物股份有限公司)；一抗兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2 基因(Bcl-2)、一抗兔抗Bcl-2相關(guān)蛋白X、天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-3；一抗鼠抗β-微管蛋白，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG；超敏ECL 發(fā)光試劑盒；聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)；Total RNApure reagent 試劑盒(北京莊盟生物基因公司)；RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；2×SYBR qPCR Mix(北京莊盟生物基因公司)；一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)(碧云天生物股份有限公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SW480、HT29、HCT15、LOVO 和NCM460 細(xì)胞株分別在添加10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每天換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 dsRNA、miRNA 序列的選擇和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-449a mimics 和mimics NC，miR-449a Inhibitor 和Inhibitor NC 由銳博生物公司設(shè)計(jì)制作。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種與6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度約為50%至80%時(shí)，根據(jù)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的不同處理分為4 組：上調(diào)組，上調(diào)對(duì)照組，下調(diào)組，下調(diào)對(duì)照組。更換無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基12h 后，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染4 至6h 后，更換新完全培養(yǎng)基，24h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)更換完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 總RNA 的提取和qPCR 分析

將轉(zhuǎn)染48h 后的收集的細(xì)胞放置在1.5mL 的離心管中，利用Trizol 法提取細(xì)胞中總RNA，然后分析細(xì)胞中miR-449a 的表達(dá)水平。miR cDNA 合成參照賽默飛世爾科技公司RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明操作。加樣完成后，將其放置在PCR 儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，運(yùn)行程序：在42℃，60min；70℃，5min。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA 做模板，按照北京莊盟生物基因公司2×SYBR qPCR Mix 試劑盒說(shuō)明操作，反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：94℃、3min、1 個(gè)循環(huán)；②PCR 擴(kuò)增：共40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括變性(94℃、15s)、退火(60℃、30s)、延伸(72℃、30s)。利用熒光定時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行上述實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)及檢測(cè)，U6snRNA作為內(nèi)參。每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-△△CT 方法分析。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞及空白組培養(yǎng)24h 后(n=4)，通過(guò)TUNEL 檢測(cè)法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況：將4 組細(xì)胞爬片用4%多基聚甲醛固定30min，PBS 緩沖液洗5min，加入含0.1% TritonX-100 的PBS 冰浴孵育2min，PBS 緩沖液沖洗2 次×10min，將TUNEL 工作液加入6 孔板中37℃避光孵育60min，PBS 緩沖液沖洗3 次×10min，DAPI 染色液染色10min，PBS 緩沖液沖洗3 次×5min，將爬片取出，抗熒光淬滅劑封片，免疫熒光顯微鏡下采集圖片。用Image-ProPlus6.0 軟件隨機(jī)抽取6 個(gè)區(qū)域分別測(cè)定TUNEL 熒光數(shù)量，DAPI 染色細(xì)胞核數(shù)量，用TUNEL 熒光數(shù)量/DAPI 細(xì)胞核數(shù)量表示凋亡細(xì)胞水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.6 Western blot

將轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞及空白組常氧培養(yǎng)24h 后(n=4)，將處理好的細(xì)胞培養(yǎng)板取出后，加入4℃預(yù)冷的PBS 溶液漂洗3 遍，吸盡殘留的PBS 溶液，加入RIPA 裂解液，于冰上裂解，30min 后用細(xì)胞刮收集蛋白，然后超速離心后取上清，運(yùn)用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，并按比例加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(10×)混勻，煮沸5min，保存于-20℃。取16μg/孔蛋白上樣，8%分離膠進(jìn)行電泳，將相應(yīng)分子量的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，BSA 封閉2h，分別與相對(duì)應(yīng)的一抗(bcl-2、bax、caspase-3、β-tublin)4℃搖床過(guò)夜，TBST 洗4 次，每次5min。再分別與抗兔的HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，TBST 洗4 次，每次5 min，最后使用ECL 化學(xué)發(fā)光。用灰度值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 細(xì)胞周期分布分析

經(jīng)過(guò)指定的處理后，用胰蛋白酶收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，然后使用細(xì)胞周期染色試劑盒(聯(lián)科生物，杭州，中國(guó))用DNA 染色溶液和碘化丙啶染色30 分鐘。通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估染色的細(xì)胞，并通過(guò)FlowJo 軟件(TreeStar，Ashland，OR，USA)分析數(shù)據(jù)。

表1 轉(zhuǎn)染各組LOVO 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞BCL-2、BAX 及caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 20.0 分析，數(shù)值均采用表示。多組比較采用單因素方差分析法，兩兩比較用LDS 法；兩組比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-449a 信使RNA 的表達(dá)量明顯下降

如圖所示(圖1)miR-449a 在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)RTqPCR 結(jié)果顯示，在人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460 和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT15、HT29、SW480、人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系LOVO 中miR-449a mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.148±0.193)、(0.062±0.043)、(0.017±0.006)、(0.002±0.003)。與正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460 中的miR-449a 信使RNA 的表達(dá)相比較，人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-449a 信使RNA 的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.001).結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，miR-449a 均呈較低表達(dá)，我們選擇LOVO 繼續(xù)后面實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460 與結(jié)腸癌細(xì)胞系的miR-449a 相對(duì)表達(dá)情況

2.2 轉(zhuǎn)染miR-449a 的mimics、Inhibitor 后細(xì)胞內(nèi)miR-449a的水平檢測(cè)(RT-qPCR)

轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 后，用RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-449a 的水平。如圖所示(圖2、3)，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì) 粒miR-449a-mimics 后，LOVO 細(xì) 胞miR-449a 表 達(dá) 量 為7945.787±848.388。轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒miR-449a Inhibitor 后，LOVO細(xì)胞miR-449a 表達(dá)量為0.593±0.064。數(shù)據(jù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

圖2 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的LOVO 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較

2.3 轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株LOVO 中miR-449a 過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)bcl-2、bax、caspase-3 的影響(Western blot)

圖3 轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒的LOVO 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較

Western blot 結(jié)果顯示，上調(diào)組的LOVO 細(xì)胞，與上調(diào)NC 組及空白組相比，caspase-3，bax 的表達(dá)升高，bcl-2 的表達(dá)下降(P均＜0.01)；而在下調(diào)組與下調(diào)NC 組、空白組相比，bcl-2、bax、caspase-3 的表達(dá)則無(wú)明顯差異(P 均＞0.05)；空白組、上調(diào)NC 組、下調(diào)NC 組各細(xì)胞組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 均＞0.05) (如圖4、表1)。

圖4 轉(zhuǎn)染各組LOVO 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞BCL-2、BAX 及caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4 轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株LOVO 中miR-449a 過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL)

TUNEL 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，和上調(diào)NC 組、空白組相比，上調(diào)組的結(jié)直腸癌細(xì)胞明顯凋亡增加(P＜0.001)，而下調(diào)組與下調(diào)NC 組、空白組則無(wú)明顯差異(P＞0.05)；空白組、上調(diào)NC組、下調(diào)NC 組各細(xì)胞組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 均＞0.05)(如圖7)。[TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞比值：空白組(0.110±0.013)；上調(diào)NC組(0.108±0.003)；上調(diào)組(0.179±0.038)；下調(diào)組(0.088±0.008)下調(diào)NC 組(0.118±0.018)]。

2.5 轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株LOVO 中miR-449a 過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

上調(diào)NC 組處于G0/G1 期的細(xì)胞百分比高于空白組和上調(diào)NC 組(P＜0.01)，出現(xiàn)明顯的G0/G1 期阻滯，下調(diào)組與下調(diào)NC 組、空白組則無(wú)明顯差異(P＞0.05)；上調(diào)組進(jìn)入S 期和G2/M 期的細(xì)胞百分比均低于空白組和上調(diào)NC 組(P 均＜0.01)，下調(diào)組與下調(diào)NC 組、空白組則無(wú)明顯差異(P 均＞0.05)；空白組與下調(diào)組、下調(diào)NC 組各細(xì)胞周期百分比比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 均＞0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 轉(zhuǎn)染各組結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞LOVO 的細(xì)胞周期百分比比較

3 討論

圖7 轉(zhuǎn)染各組LOVO 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞tunel 表達(dá)量

結(jié)腸癌的發(fā)生是遺傳、飲食、環(huán)境、生活習(xí)慣及腸道微生態(tài)等多因素共同作用的結(jié)果，在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)[6]。由于相關(guān)預(yù)防保健知識(shí)的缺乏，在我國(guó)及其他發(fā)展中國(guó)家，大多數(shù)結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，分子靶向治療在晚期腫瘤治療中的運(yùn)用，已經(jīng)成為治療的新關(guān)注點(diǎn)[7]。研究表明，多種miRNA 在結(jié)直腸癌中有比較重要的作用。本研究通過(guò)檢測(cè)了幾種常見(jiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞株和人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460 中miR-449a 的表達(dá)，結(jié)果證明了在結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-449a 也呈較低表達(dá)。

作為脊椎動(dòng)物中進(jìn)化保守的miRNA，miR-449a 在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中的作用也受到廣泛關(guān)注.研究發(fā)現(xiàn)，miRNAa 在肝癌、膀肌癌、結(jié)腸癌及胃癌病人的癌組織中的表達(dá)普遍低于癌旁正常組織[8-11]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)而過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480 和轉(zhuǎn)移癌lovo 中miR-449a，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，miR-449a 明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，bcl-2 蛋白表達(dá)下降較顯著，而bax、caspase-3蛋白的表達(dá)卻上調(diào)。

Bcl-2 是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)抑制細(xì)胞色素C 從線粒體膜間隔釋放到細(xì)胞質(zhì)中而發(fā)揮其抗凋亡功能[12]。有軟件預(yù)測(cè)bcl-2 很有可能是miR-449a 的一個(gè)靶向結(jié)合基因[13]，而miRNA 能夠與靶基因mRNA3’-UTR 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有資料顯示，在多種腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有caspase 的活化[14-15]。因此，我們推測(cè)miR-449a 的異常表達(dá)可能結(jié)腸癌具有相關(guān)性，可能是通過(guò)下調(diào)靶基因bcl-2 的表達(dá)而引起bax 蛋白的改變，同時(shí)激活了caspase-3 蛋白的表達(dá)，最終引起了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。當(dāng)然，miR-449a 可能也有很多其他的靶基因，通過(guò)改變這些個(gè)基因的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡，這也是今后繼續(xù)研究的方向和切入點(diǎn)。