梅陽陽 林偉

【摘 要】目的：觀察補(bǔ)腎壯筋湯（BZD）對(duì)毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響。方法：①RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)TG（2 μmol·L-1）誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞中蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、真核翻譯起始因子（Eif2α）、激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（GADD153）mRNA表達(dá);②Western Blot法檢測(cè)經(jīng)TG誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白含量表達(dá)。結(jié)果：①RT-PCR結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎壯筋湯200，400，600 μg·mL-1組的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153mRNA含量表達(dá)均呈降低趨勢(shì);②Western Blot結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎壯筋湯200，400，600 μg·mL-1組的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白含量表達(dá)顯著降低，尤其400 μg·mL-1組降低更顯著（P < 0.01）。結(jié)論：補(bǔ)腎壯筋湯可通過下調(diào)TG誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA與蛋白含量表達(dá)，進(jìn)而延緩大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞退變。

【關(guān)鍵詞】 椎間盤軟骨退變;補(bǔ)腎壯筋湯;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;毒胡蘿卜素;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Bushen Zhuangjin Tang（補(bǔ)腎壯筋湯，BZT）on the endoplasmic reticulum stress in rats with intervertebral disc chondrocytes induced by thapsigargin.Methods：①RT-PCR was used to detect the expressions of PERK，Eif2α，ATF4 and GADD153 mRNA in rats with intervertebral disc chondrocytes induced by thapsigargin（2 μmol·L-1）.②Western Blot was used to detect the protein expressions of PERK，Eif2α，ATF4 and GADD153.Results：①RT-PCR showed that compared with the model control group，the expressions of PERK，Eif2α，ATF4 and GADD153 mRNA in the groups of BZT 200，400，600 μg·mL-1 decreased;②Western Blot showed that compared with the model control group，the protein expressions of PERK，Eif2α，ATF4 and GADD153 in above three groups significantly decreased，especially in the group of BZT 400 μg·mL-1（P < 0.01）.Conclusion：BZT can delay the degeneration of chondrocytes by way of down regulating PERK，Eif2α，ATF4 and GADD153 mRNA and protein expression.

【Keywords】 intervertebral disc chondrocytes;Bushen Zhuangjin Tang（補(bǔ)腎壯筋湯）;endoplasmic reticulum stress;thapsigargin;rats

脊柱椎間盤發(fā)生漸進(jìn)性退變是引起脊柱退行性疾病（腰、頸椎退行性病變）的關(guān)鍵因素，而椎間盤退變的重要病理事件在于椎間盤軟骨細(xì)胞因生物因素及力學(xué)異常改變，致使軟骨終板（椎間盤軟骨細(xì)胞）合成代謝功能偶聯(lián)失衡，導(dǎo)致椎間盤微環(huán)境、脊柱各關(guān)節(jié)及脊柱間組織的形態(tài)與功能受損，最終誘發(fā)脊柱關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1-3]。而脊柱椎間盤關(guān)節(jié)軟骨退變引起的骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，其主要病因?yàn)椤氨攫魳?biāo)痹”“本虛標(biāo)實(shí)”，故對(duì)其治療宜補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕[4]。

補(bǔ)腎壯筋湯源于清代《傷科補(bǔ)要》，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨的作用，切合骨痹的治則[5]。臨床研究顯示，補(bǔ)腎壯筋湯可有效改善脊柱關(guān)節(jié)病的臨床癥狀，延緩疾病進(jìn)展[6-7]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)脊柱骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可直接損傷軟骨細(xì)胞和基質(zhì)成分，從而參與骨關(guān)節(jié)炎的病理過程[8]。其中蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）作為活躍在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ⅱ型跨膜蛋白，可通過二聚化和磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨蚉ERK，進(jìn)而參與真核翻譯起始因子（Eif2α）的磷酸化過程，進(jìn)而引起GTP-GDP轉(zhuǎn)化障礙，從而阻止蛋白合成[9];隨著Eif2α的磷酸化，可使激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）水平表達(dá)升高，而后者可促進(jìn)生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（GADD153）的表達(dá)，進(jìn)而引起鈣離子通道活化，引起Caspase-12激活，并激活下游的效應(yīng)組Caspase，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡[10-11]。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)腎壯筋湯對(duì)毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響，初步探討與闡釋其延緩大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞退變的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SD雄性大鼠（SPF級(jí)）

18只，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK2014-0001（閩），體質(zhì)量90 g。

1.2 主要試劑 補(bǔ)腎壯筋湯組方藥材（熟地黃12 g、

山茱萸12 g、杜仲10 g、續(xù)斷12 g、五加皮10 g、當(dāng)歸12 g、白芍10 g、茯苓12 g、青皮5 g、牛膝10 g）購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;瓊脂糖（Biowest Agarose）;核酸染料（Solarbio）;DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）;磷酸鹽緩沖液（HyClone）;TRIZOL（美國(guó)Life公司）;PERK、Eif2α、ATF4、GADD153、β-actin引物（上海生工）;一抗（兔抗），PERK（bs-2469R）、Eif2α（bs-3613R）、ATF4（bs-1531R）、GADD 153（bs-8875R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）;β-actin（ab179467，Abcam）;二抗（羊抗兔）（美國(guó)CST公司）;1-StepTM Transfer Buffer（批號(hào)PA196400，Thermo）;ECL高效顯影液（Thermo）等。

1.3 主要儀器 離心機(jī)（高速低溫型，美國(guó)BECKMAN）;超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型，蘇州安泰）;凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國(guó)BIO-RAD）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國(guó)Heraus）;DNA擴(kuò)增儀（9600型，美國(guó)PE）;熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本TKO）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIO-TEK ELX800型，美國(guó)BIO-Tek）等。

2 方 法

2.1 補(bǔ)腎壯筋湯水提物的制備 精確稱取熟地黃12 g、山茱萸12 g、杜仲10 g、續(xù)斷12 g、五加皮10 g、當(dāng)歸12 g、白芍10 g、茯苓12 g、青皮5 g、牛膝10 g，水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽濾，濃縮成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重;待經(jīng)低溫下研磨成粉末狀，精確稱量浸膏50 mg，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的FBS培養(yǎng)基5 mL溶解，超聲10 min，再經(jīng)0.22 μL無菌濾嘴濾過后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，配?0 mg·mL-1補(bǔ)腎壯筋湯水提物母液，備用[12]。

2.2 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 4周齡SD大鼠直接經(jīng)戊巴比妥鈉（質(zhì)量濃度2%，按40 mg·kg-1腹腔膜注射）麻醉后行脫頸椎處死，分離并收集大鼠頸、腰椎椎間盤軟骨終板組織，修剪至每單位體積1 mm3，PBS輕柔漂洗后倒凈，使用移液槍加入

Ⅱ型膠原酶（質(zhì)量濃度0.2%）進(jìn)行初次消化，收集上清液至15 mL離心管中，經(jīng)離心后棄上清液保留軟骨細(xì)胞沉淀團(tuán)塊，吸取DMEM（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清），重懸吹勻沉淀，軟骨細(xì)胞經(jīng)精確計(jì)數(shù)（2×105個(gè)·mL-1）后移種至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行孵育培養(yǎng)[4]。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 在六孔板各孔中央部接種含有

二代軟骨細(xì)胞的重懸液（1×105個(gè)·mL-1），待軟骨細(xì)胞爬片孵育后，標(biāo)記分為5組：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，補(bǔ)腎壯筋湯水提物200，400，600 μg·mL-1組。①空白對(duì)照組：使用移液槍添加2 mL體積/單孔的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM），4 h后再換新的正常培養(yǎng)基繼續(xù)作用48 h。②模型對(duì)照組：參照課題組前期研究[13]，即每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培養(yǎng)基2 mL，干預(yù)4 h后再換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)作用48 h。③補(bǔ)腎壯筋湯水提物200 μg·mL-1組：先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培養(yǎng)基2 mL，4 h后再換為含200 μg·mL-1補(bǔ)腎壯筋湯水提物的培養(yǎng)基繼續(xù)作用48 h。④補(bǔ)腎壯筋湯水提物400 μg·mL-1組：先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培養(yǎng)基2 mL，4 h后再換為含400 μg·mL-1補(bǔ)腎壯筋湯水提物的培養(yǎng)基繼續(xù)作用48 h。⑤補(bǔ)腎壯筋湯水提物600 μg·mL-1組：先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培養(yǎng)基2 mL，4 h后再換為含600 μg·mL-1補(bǔ)腎壯筋湯水提物的培養(yǎng)基繼續(xù)作用48 h[14]。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)PERK、Eif2α、ATF4、GADD153mRNA表達(dá) PCR條件為94 ℃ 4 min條件下首先進(jìn)行預(yù)變性，循環(huán)35次（94 ℃ 30 s、退火58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s），后置于72 ℃ 10 min，并于4 ℃保存;制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠，上樣后，在100 V、70 mA、15 min條件下電泳，使用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager圖象分析儀下掃描，經(jīng)分析后拍照存檔。RT-PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)基因的引物序列見表1。

2.5 Western Blot法檢測(cè)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表達(dá) 提取各組大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞總蛋白，BCA進(jìn)行蛋白定量，配制體積分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和體積分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠;上樣后進(jìn)行電泳，采用半干式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉2 h后洗膜;再將各條膜放入預(yù)先配置好的β-actin（1∶1000）、PERK、Eif2α、ATF4、GADD153（1∶1000）的一抗中4 ℃冰箱搖床震蕩過夜，漂洗3遍（每遍10 min）后置于二抗（1∶5000）封閉袋中室溫反應(yīng)1 h;再漂洗3遍（每遍10 min），最后配制ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，在凝膠成像儀下曝光成像并分析儲(chǔ)存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2所示，補(bǔ)腎壯筋湯水提物200，400，600 μg·mL-1作用于經(jīng)TG誘導(dǎo)退變的大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞后，可下調(diào)PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA含量表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞在一定程度上發(fā)生退變;在PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA指標(biāo)上，與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎壯筋湯水提物200，400，600 μg·mL-1組的mRNA含量均降低，尤其400 μg·mL-1組降低更顯著（P < 0.01），提示補(bǔ)腎壯筋湯水提物可通過調(diào)控PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA表達(dá)延緩大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞的退變進(jìn)程。

3.2 PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 Western Blot結(jié)果如圖3、圖4所示，在PERK、Eif2α、ATF4、GADD153指標(biāo)上，與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎壯筋湯水提物200，400，600 μg·mL-1組的蛋白含量均降低，尤其以400 μg·mL-1組的表達(dá)量最低（P < 0.01），提示狗脊多糖在一定程度上通過調(diào)控PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表達(dá)，發(fā)揮延緩軟骨細(xì)胞退變作用。

4 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與調(diào)控軟骨退變的病理進(jìn)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是獨(dú)立于Fas途徑和一氧化氮途徑的細(xì)胞凋亡途徑。研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響軟骨細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞的合成功能，細(xì)胞可調(diào)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白減輕應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的損傷，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應(yīng)新的內(nèi)環(huán)境要求;同時(shí)細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白如GADD153、Caspase-12等，可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡來處理不能修復(fù)的損傷細(xì)胞，減輕應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損害。但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，隨著病情的發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過載，會(huì)通過GADD153的高表達(dá)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡[15-17]。

椎間盤關(guān)節(jié)軟骨退變屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，基于陳可冀院士學(xué)術(shù)思想認(rèn)識(shí)，其主要病理表現(xiàn)為“軟骨退行性病變的同時(shí)伴有新骨形成”，故對(duì)其治療的根本法則為補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕[18]，補(bǔ)腎壯筋湯具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血功效，本方以熟地黃、山茱萸為君藥，補(bǔ)肝益腎、填精補(bǔ)髓;續(xù)斷、杜斷、五加皮協(xié)助君藥補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨，并兼祛風(fēng)除濕;佐以當(dāng)歸活血補(bǔ)血，白芍?jǐn)筷幒蜖I(yíng)、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除濕，青皮行氣疏肝;牛膝作為引經(jīng)下行藥，助以補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、通經(jīng)活絡(luò)。諸藥合用，共奏其功，發(fā)揮“從本治痿，從標(biāo)治痹”作用，切中病機(jī)。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯筋湯可降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量分解，減輕膠原纖維變性程度，發(fā)揮延緩骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退變作用[19-20]。此外，LIN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯筋湯水提物400 μg·mL-1可顯著改善衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡，其調(diào)控機(jī)制為降低Bip、ATF4、Chop、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA與蛋白含量表達(dá)，進(jìn)而阻止軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程。而TG是Ca2+-ATP酶抑制劑，其作為引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，可使未折疊或異常折疊的蛋白在軟骨細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蓄積或誘使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+失穩(wěn)，引發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯筋湯干預(yù)TG誘導(dǎo)的大鼠椎間盤退變軟骨細(xì)胞48 h后，可顯著下調(diào)PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA與蛋白含量表達(dá)（P < 0.01），進(jìn)而提示補(bǔ)腎壯筋湯可通過下調(diào)大鼠椎間盤退變關(guān)節(jié)軟骨中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA、蛋白信號(hào)分子含量表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞作用。

綜上所述，補(bǔ)腎壯筋湯延緩大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞退變的機(jī)制為通過下調(diào)大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA與蛋白含量表達(dá)，這為補(bǔ)腎壯筋湯在臨床中治療脊柱關(guān)節(jié)退變等疾病提供了部分實(shí)驗(yàn)支持;但其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的更深層次的作用機(jī)制，如是否通過相應(yīng)的Lnc RNA與micro RNA進(jìn)行靶點(diǎn)調(diào)節(jié)，尚需深入探究。

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收稿日期：2019-05-26;修回日期：2019-08-29