皇甫俊靜，趙鈺瑩，冉 浪，馮美玲，張 豪，李次力

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

黃瓜原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓，西漢時(shí)期由張騫出使西域帶回中原地區(qū)，根據(jù)《拾遺錄》 上說(shuō)：“隋大業(yè)四年避諱，改胡瓜為黃瓜?！秉S瓜含水分約95%，性味甘涼，有清熱利水、解毒的功效，且能治四肢浮腫、清肺熱、解火毒，可降低膽固醇[1]。黃瓜富含蛋白質(zhì)、糖類、維B2、維C、尼克酸、鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能強(qiáng)心降壓、預(yù)防心肌過(guò)度緊張和動(dòng)脈粥樣硬化，還可增強(qiáng)記憶力[2]、安神定志、輔助治療失眠。此外，黃瓜中的黃瓜酶具有強(qiáng)生物活性，可促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝；丙醇二酸可抑制人體內(nèi)糖類轉(zhuǎn)化為脂肪，阻止體內(nèi)脂肪堆積，具有減肥和預(yù)防冠心病的功效[3]。

李時(shí)珍的《本草綱目》中有紅曲藥用價(jià)值的記載：“消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷，釀酒，破血行藥勢(shì)，殺山嵐瘴氣，治打撲傷，治女人血?dú)馔醇爱a(chǎn)后惡血不盡，擂酒飲之，良[4]”。紅曲菌絲體蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%左右，含17 種氨基酸，其中必需氨基酸占7%左右[5]。根據(jù)中醫(yī)理論，利用紅曲與中藥材復(fù)配，中醫(yī)理論認(rèn)為高血脂基本病機(jī)為脾失健運(yùn)、痰濁內(nèi)生，健脾化痰、活血化瘀是治療高血脂癥的根本原則[6]，若與黃瓜合理配伍，從本源上改善高血脂患者體質(zhì)，則可發(fā)揮更大的作用。

酵素是一種在日本和我國(guó)臺(tái)灣非常流行的植物性功能食品，又稱為酶，是產(chǎn)生于生物體內(nèi)具有催化作用的活性大分子[7]。酵素作為一種生物催化劑參與機(jī)體代謝活動(dòng)[8-10]。目前，關(guān)于使用紅曲酶對(duì)黃瓜進(jìn)行二次發(fā)酵的代餐酵素鮮有報(bào)道，試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇溫度、pH 值、碳源補(bǔ)充量3 個(gè)主要因素探究其對(duì)發(fā)酵代謝物酶活性的影響程度，以期為優(yōu)質(zhì)果蔬代餐的生產(chǎn)提供參考。

試驗(yàn)以黃瓜為原料，發(fā)酵工業(yè)中常用的酵母菌和紅曲酶菌為發(fā)酵菌種，通過(guò)榨汁、發(fā)酵、離心、干燥等步驟，制成黃瓜酵素產(chǎn)品，以POD 酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黃瓜酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮黃瓜、酵母菌、紅曲酶菌、白砂糖，均為市售；過(guò)氧化氫、愈創(chuàng)木酚，均為化學(xué)純；醋酸、醋酸鈉，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

BPH-9162 型精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DT5-1 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；JA5003 型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；Pilot2-4LD 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-2F型pH 計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程

黃瓜→冷凍榨汁→加入蔗糖調(diào)配→酵母活化后接種→一次發(fā)酵→過(guò)濾→滅菌→紅曲酶活化后接種→二次發(fā)酵→過(guò)濾→滅菌→酵素原液→冷凍干燥→酵素粉。

1.4 操作要點(diǎn)

（1）原材料預(yù)處理。用清水將新鮮的黃瓜清洗干凈后，冷凍2～3 d（5～10 ℃），自然解凍、去皮、切碎，添加與黃瓜同質(zhì)量的水于榨汁機(jī)中榨汁，經(jīng)紗布過(guò)濾后，再用離心機(jī)過(guò)濾[11]。

（2）一次發(fā)酵。取一定量酵母置于質(zhì)量濃度為30 g/L 的蔗糖溶液中，混勻，于35 ℃條件下恒溫水浴活化30 min；黃瓜汁中加入活化酵母種子液，攪拌均勻后置于培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵。

（3）二次發(fā)酵。將一定量紅曲霉用適量水潤(rùn)濕，于35 ℃條件下恒溫水浴活化1 h；將活化后的紅曲霉和殺菌后的一次發(fā)酵液混勻后置于培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵。

（4）過(guò)濾、殺菌。一次或二次發(fā)酵完畢需將發(fā)酵液真空抽濾，濾液于65 ℃條件下恒溫水浴30 min，而后自然冷卻至室溫[12]。

（5）冷凍干燥。將發(fā)酵液分批導(dǎo)入培養(yǎng)皿中，置于-20 ℃以下的低溫冷凍冰箱中冷凍48 h，再放入冷凍干燥機(jī)中，先在-80 ℃條件下冷藏24 h，于-80 ℃條件下抽真空24 h，最終得到粉末狀產(chǎn)品[13]。

1.5 酵母菌一次發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.5.1 酵母菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度確定

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，為使黃瓜汁發(fā)酵充分，初始pH 值5.0，補(bǔ)充碳源量7%，發(fā)酵溫度分別設(shè)為22，25，28，31，34，37 ℃，發(fā)酵24 h；待發(fā)酵完畢，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定初始發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度。

1.5.2 酵母菌發(fā)酵所需最佳發(fā)酵時(shí)間確定

將恒溫發(fā)酵溫度34 ℃，補(bǔ)充碳源量7%，初始pH 值 5.0，發(fā)酵時(shí)間依次設(shè)為 18，20，22，24，26，28 h；待發(fā)酵完畢，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定初始發(fā)酵所需最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.5.3 酵母菌發(fā)酵的最佳初始pH 值確定

將發(fā)酵溫度恒定34℃，補(bǔ)充碳源量7%，初始pH 值分別設(shè)為 3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，6.0，控制恒溫26 h；待發(fā)酵完畢，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定初始發(fā)酵的最適初始pH 值。

1.5.4 酵母菌發(fā)酵最佳碳源補(bǔ)充量確定

由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將發(fā)酵溫度恒定34 ℃，初始pH 值5.0，補(bǔ)充碳源量依次設(shè)置為1%，3%，5%，7%，9%，11%，恒溫26 h 發(fā)酵后，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定初始發(fā)酵的最佳補(bǔ)充碳源量。

1.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化黃瓜酵素酵母菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件

經(jīng)單因素試驗(yàn)可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH 值、碳源補(bǔ)充量是影響酵母菌初次發(fā)酵黃瓜汁的主要因素。因此，以POD 活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，探究酵母菌初始發(fā)酵黃瓜汁的最佳制備工藝。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.7 紅曲霉菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.7.1 確定紅曲霉菌發(fā)酵的最佳初始pH 值

初始發(fā)酵pH 值會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵速率和品質(zhì)。由預(yù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，將發(fā)酵溫度恒定34 ℃，紅曲酶接種量10%，分別調(diào)節(jié)pH 值為3，4，5，6，發(fā)酵50 h 后，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定紅曲霉菌發(fā)酵黃瓜的最適pH 值。

1.7.2 確定紅曲霉菌發(fā)酵的最佳紅曲霉接種量

恒溫發(fā)酵溫度34 ℃，pH 值4.0，紅曲霉接種量分別為0，5%，10%，15%，20%，在此基礎(chǔ)上發(fā)酵50 h 后，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定紅曲霉菌發(fā)酵黃瓜的最佳接種量。

1.7.3 確定紅曲霉菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵溫度恒定34 ℃，pH 值4.0，紅曲霉接種量10%，在此基礎(chǔ)上發(fā)酵時(shí)間依次設(shè)為40，50，60，70 h 進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵完畢后，從培養(yǎng)箱中取適量發(fā)酵液檢測(cè)，以POD 酶活性為測(cè)定指標(biāo)，確定紅曲霉菌發(fā)酵黃瓜的最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.8 二次發(fā)酵產(chǎn)物真空冷凍干燥

將發(fā)酵液分批導(dǎo)入培養(yǎng)皿中，置于低溫冷凍冰箱中，于-20 ℃以下冷凍48 h，再放入冷凍干燥機(jī)中先-80 ℃冷藏24 h，再進(jìn)行-80 ℃真空冷凍干燥，真空度5～15 Pa，干燥時(shí)間24 h，最終得到黃瓜汁酵素粉末狀產(chǎn)品。

1.9 POD 活性測(cè)定

發(fā)酵液全部置入離心管，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心，于4 ℃條件下保持2 min，酶的粗提取液為上清液。將4 mL 反應(yīng)液（醋酸緩沖液2 mL，酶液1 mL，0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚 1 mL）和 1 mL 3%的 H2O2加入試管，即刻搖勻并快速倒入1 mL 比色皿中，于波長(zhǎng)470 nm 處用722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)比色，即刻記錄吸光度，隔30 s 記一次，共記5 min，用緩沖液取代酶液作對(duì)照。

式中：ΔOD——反應(yīng)起始速度階段的吸光度差值，比色波長(zhǎng)為470 nm；

Δt——ΔOD 對(duì)應(yīng)的時(shí)間，min；

Δt/ΔOD——直線部分的斜率，此段吸光度與反應(yīng)時(shí)間成正比；

V1——提取酶液的總體積，mL；

V2——測(cè)定時(shí)取用的提取酶液體積，mL；

W——黃瓜樣品的鮮質(zhì)量，g；

0.01 ——以吸光度（ΔOD）改變0.01 為1 個(gè)酶活單位 （U）[14-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酵母菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵溫度對(duì)一次發(fā)酵酶活性的影響。

發(fā)酵溫度對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖1。

由圖1 可得以下結(jié)論，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果有顯著影響，當(dāng)發(fā)酵溫度小于34 ℃時(shí)，酶活性隨時(shí)間增加迅速增加；當(dāng)發(fā)酵溫度大于34 ℃時(shí)，酶活性有驟減趨勢(shì)。因此，最佳發(fā)酵溫度為34 ℃。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)一次發(fā)酵酶活性的影響。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖2。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響

由圖2 可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果有顯著影響。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于26 h 時(shí)，酶活性隨時(shí)間增加而迅速增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于26 h 時(shí)，酶活性有下降趨勢(shì)。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為26 h。

（3）初始pH 值對(duì)一次發(fā)酵酶活性的影響。

初始pH 值對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 初始pH 值對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響

由圖3 可知，初始pH 值對(duì)一次發(fā)酵后酶的活性影響趨勢(shì)較顯著，當(dāng)初始pH 值為5.0 時(shí)，發(fā)酵效果最佳。因此，發(fā)酵最佳初始pH 值為5.0。

（4）碳源補(bǔ)充量對(duì)一次發(fā)酵酶活性的影響。

碳源補(bǔ)充量對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 碳源補(bǔ)充量對(duì)一次發(fā)酵后酶活性的影響

由圖4 可知，碳源補(bǔ)充量對(duì)二次發(fā)酵后酶的活性影響趨勢(shì)較顯著，相比之下，當(dāng)發(fā)酵碳源補(bǔ)充量為3%時(shí)，發(fā)酵效果最佳。因此，發(fā)酵最佳碳源補(bǔ)充量為3%。

2.1.2 酵母菌發(fā)酵的正交試驗(yàn)

黃瓜酵素酵母菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，黃瓜酵素酵母菌發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

表2 黃瓜酵素酵母菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 黃瓜酵素酵母菌發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析

由表2 可知，以POD 酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)得發(fā)酵液中POD 酶活性知，4 個(gè)因素對(duì)酵母菌發(fā)酵黃瓜汁有不同影響，且影響作用大小不同。按影響作用大小排序?yàn)锳>B>C>D，最佳組合的結(jié)果為A1B3C1D4，其中發(fā)酵時(shí)間對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的影響作用較其他3 個(gè)影響因素偏小。

2.2 紅曲霉菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵pH 值對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

發(fā)酵pH 值對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，發(fā)酵pH 值對(duì)二次發(fā)酵后酶的活性影響趨勢(shì)較顯著，當(dāng)發(fā)酵pH 值為4.0 時(shí)，發(fā)酵效果最佳。因此，發(fā)酵最佳pH 值為4.0。

2.2.2 紅曲霉接種量對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

紅曲霉菌接種量對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖6。

圖5 發(fā)酵pH 值對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

圖6 紅曲霉菌接種量對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

由圖6 可知，紅曲霉菌接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響較顯著，當(dāng)接種量小于10%時(shí)，酶活性隨接種量的增加而增大；但當(dāng)其接種量大于10%時(shí)，酶活性有下降趨勢(shì)。因此，紅曲霉菌的最佳接種量為10%。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)二次發(fā)酵后酶活性的影響

由圖3 可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果有顯著影響，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于50 h 時(shí)，酶活性隨時(shí)間增加而迅速增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于50 h 時(shí)，酶活性則隨發(fā)酵時(shí)間增加迅速減小。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為50 h。

2.3 真空冷凍干燥二次發(fā)酵產(chǎn)物

該產(chǎn)品色澤呈紅色，無(wú)小塊聚集的粉末，口感清新，有香氣，有甜味；理化指標(biāo)為水分含量≤7%，過(guò)氧化物歧化酶含量≥30±3 U/g。

3 結(jié)論

以黃瓜為原料，采用工業(yè)生產(chǎn)中常用的釀酒酵母和紅曲霉菌為菌種，通過(guò)正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)，得到了一次發(fā)酵和二次發(fā)酵的最佳條件。一次發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度34 ℃，初始pH 值5.0，碳源補(bǔ)充量3%，發(fā)酵時(shí)間26 h；二次發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵時(shí)間50 h，發(fā)酵pH 值4，紅曲霉接種10%。冷凍干燥的最佳條件為-80 ℃真空冷凍干燥，真空度5～15 Pa，時(shí)間24 h，最終得到粉末狀酵素產(chǎn)品。在今后的研究中，可嘗試用其他菌種發(fā)酵，豐富產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，增加產(chǎn)品的附加值。