董 苑，李彩霞，趙 嫻，駝曉宇，劉 流，馬 蕓

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，云南昆明 650032；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，云南 昆明 650500）

臨床上多種疾病可能造成人體骨組織的缺損，小范圍的骨缺損可以自行修復(fù)，但大范圍的骨缺損并不能完全自行修復(fù)[1]。骨缺損的研究在組織工程研究領(lǐng)域的地位非常重要，在從動(dòng)物試驗(yàn)通向臨床研究的過程中，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型，筆者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型的要求是制作的骨缺損范圍一致性，可重復(fù)性好，以達(dá)到研究結(jié)果嚴(yán)謹(jǐn)?shù)哪康腫2]。骨損傷發(fā)生后，局部微環(huán)境發(fā)生變化，局部會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)各種細(xì)胞尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、趨化、黏附、增殖和分化起到了尤為重要的作用[3]。其中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1） 是其中尤為重要的一員，SDF-1 是一種分泌型蛋白，屬于CXC 趨化因子亞家族成員，在骨缺損修復(fù)過程中起到重要作用[4]。骨損傷出現(xiàn)后，局部SDF-1 分泌迅速增加，SDF-1 促使周圍CXCR4+干細(xì)胞向骨損傷部位趨化遷移。因此，深入研究SDF-1 在骨缺損修復(fù)中的動(dòng)態(tài)變化為研究干細(xì)胞趨化促進(jìn)骨再生修復(fù)提供重要的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)為求探尋更優(yōu)的小鼠骨缺損模型制作方法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)骨缺損局部SDF-1 表達(dá)，了解其動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)及特點(diǎn)。為求進(jìn)一步了解SDF-1 在骨損傷修復(fù)過程中的作用及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

健康成年昆明鼠35 只，雄性，體重（19～25）g 普通飲食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。打磨機(jī)（SAEYANG MARATHON-3），SDF-1 抗體（Abcam，編號(hào)：ab25117，稀釋比例1:100），EnvisionTM 試劑盒，抗體稀釋液，DAB顯色劑（Dako）。光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠股骨缺損模型的構(gòu)建 麻醉：0.5%戊巴比妥鈉，5 mg/kg 腹腔注射麻醉。顯露：右膝關(guān)節(jié)上方偏外側(cè)平行股骨切口，顯露股骨中段。制造骨缺損：使用SAEYANG MARATHON-3 打磨機(jī)，制造骨缺損范圍約2 mm×2 mm，使用打磨機(jī)過程中局部滴注生理鹽水以避免局部熱損傷產(chǎn)生局部炎癥。術(shù)畢縫合肌膜和皮膚。術(shù)后管理：口服抗生素，局部固定，正常喂養(yǎng)（見圖1）。

圖1 小鼠股骨缺損建立過程Fig.1 Establishment of mouse femoral defect

1.2.2 小鼠骨缺損部位SDF-1 動(dòng)態(tài)表達(dá)的檢測(cè)（免疫組化法） 模型制作成功后的小鼠正常喂養(yǎng)，定期處死小鼠（術(shù)后第1、2、4、7、14 天，每次處死7 只），分別對(duì)骨缺損側(cè)股骨及對(duì)側(cè)股骨取材，常規(guī)固定，石蠟包埋，切片。SDF-1 免疫組化染色。

SDF-1 陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀。我們將小鼠脾臟進(jìn)行染色，已知B 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判讀：采用半定量計(jì)分方式。按著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)兩種評(píng)分結(jié)合。（1） 按染色強(qiáng)度來分，3 分，棕褐色；2 分，棕黃色或金黃色；1分，淡黃色；0 分，無著色。（2） 按陽性細(xì)胞數(shù)：選擇染色比較均勻的陽性表達(dá)區(qū)域，選取5 個(gè)HP計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占比。4 分，陽性細(xì)胞率＞75%；3分，陽性細(xì)胞率51%～75%；2 分，陽性細(xì)胞率26%～50%；1 分，陽性細(xì)胞率5%～25%；0 分，陽性細(xì)胞率＜5%。最后評(píng)分由強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)兩種評(píng)分相加而得，6～7 分為強(qiáng)陽性（+++），4～5 分為陽性（++），2-3 分為弱陽性（+），0-1 為陰性（-），所有結(jié)果判讀均由兩名病理醫(yī)師獨(dú)立完成，若出現(xiàn)評(píng)分不一致情況則重復(fù)觀察后再進(jìn)行結(jié)果確定[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)不同時(shí)間段處死小鼠骨缺損側(cè)和未手術(shù)側(cè)SDF-1 表達(dá)評(píng)分之間結(jié)果比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

骨缺損制作過程順利，耗時(shí)短，制作過程中骨缺損斷面光滑，無不規(guī)則斷裂面及碎骨形成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物除一只在術(shù)中意外死亡外，其余均存活至正常處死，局部創(chuàng)面未出現(xiàn)感染及血腫形成等情況。

SDF-1 術(shù)后動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明，骨缺損模型建立后，骨缺損區(qū)域局部SDF-1 表達(dá)評(píng)分明顯增高，并在不同時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)，且局部陽性程度較健康無骨缺損側(cè)明顯增高（見圖2，圖3）。二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明在骨缺損發(fā)生后，局部SDF-1 分泌明顯增多，且能在骨缺損后的不同時(shí)間點(diǎn)持續(xù)分泌。

圖2 SDF-1 免疫組化染色（×400）Fig.2 Immunohistochemical staining of SDF-1（×400）

圖3 SDF-1 骨缺損側(cè)和未手術(shù)側(cè)表達(dá)評(píng)分結(jié)果Fig.3 SDF-1 expression scores on the defect side and the non-operation side

3 討論

骨缺損研究是組織工程修復(fù)中的重要研究領(lǐng)域，在此研究領(lǐng)域中，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性及可重復(fù)性，只有這樣，才能更好地從實(shí)驗(yàn)研究向臨床研究轉(zhuǎn)化[3]，因此，在骨缺損修復(fù)的研究過程中，對(duì)骨缺損模型的要求是簡(jiǎn)便易行、可重復(fù)性好、一致性好，因此選擇何種方式建立骨缺損是需要思考的問題。而骨缺損模型中，骨缺損范圍大小建多大也至關(guān)重要，筆者知道，骨缺損的大小和愈合率呈負(fù)相關(guān)。Van Steenberghe D[6]曾經(jīng)指出，在小鼠中＜2 mm 的骨缺損不作處理即可獲得良好的修復(fù)。傳統(tǒng)構(gòu)建骨缺損模型常用的方法是使用骨鉗，但骨鉗的力度和范圍較難掌握，容易出現(xiàn)骨質(zhì)碎片及不規(guī)則斷面而造成骨缺損模型的不一致性。在本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的骨缺損模型位于股骨，范圍約2 mm×2 mm，制作過程中未使用傳統(tǒng)骨鉗而使用打磨機(jī)對(duì)局部骨質(zhì)進(jìn)行打磨發(fā)現(xiàn)，打磨機(jī)對(duì)于骨缺損制作的大小范圍較傳統(tǒng)骨鉗可控制性好，制作過程快速，不易造成骨折及不規(guī)則缺損面，動(dòng)物模型一致性強(qiáng)。因此，筆者通過打磨機(jī)制作的小鼠骨缺損動(dòng)物模型為組織工程骨缺損的領(lǐng)域的研究提供了較好的動(dòng)物模型。

機(jī)體發(fā)生骨缺損或者骨折后，局部出現(xiàn)出血及血腫形成，局部可產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子的釋放及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，在局部組織修復(fù)的過程中，血腫逐漸由肉芽組織替代，血腫機(jī)化進(jìn)而進(jìn)行局部修復(fù)。因此，筆者知道細(xì)胞因子的釋放在骨缺損修復(fù)過程中起到了非常關(guān)鍵的作用。SDF-1 就是以上細(xì)胞因子中非常重要的一員。SDF-1 是一種分泌型蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量高度保守，是CXC 趨化因子亞家族的成員。SDF-1 在許多正常組織都有表達(dá)。SDF-1 特異性受體為CXCR4，SDF-1 與CXCR4 特異性結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。體內(nèi)許多細(xì)胞表面都表達(dá)CXCR4 受體，包括所有CD34+細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。SDF-1 與其特異性受體CXCR4 結(jié)合可以參與體內(nèi)許多生物學(xué)過程，其中調(diào)控及參與干細(xì)胞歸巢方面的研究最為受到重視。Ali 等[7]通過SDF-1/CXCR4 軸水平的調(diào)節(jié)，可影響間充實(shí)干細(xì)胞在大鼠模型中的歸巢。Yu Y 等[8]發(fā)現(xiàn)炎癥及缺氧刺激導(dǎo)致的SDF-1 變化可增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢。研究表明[9-10]，當(dāng)局部組織損傷后，SDF-1分泌明顯增加，通過SDF-1/CXCR4 軸的作用，可促使CXCR4+的干細(xì)胞向損傷的部位發(fā)生定向遷移，干細(xì)胞發(fā)生趨化及分化，參與組織的修復(fù)和再生。于此同時(shí)，筆者研究組也曾發(fā)現(xiàn)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞可以促進(jìn)骨缺損部位SDF-1 分泌從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等歸巢而加強(qiáng)骨缺損修復(fù)過程[11]。因此，通過對(duì)SDF-1 在組織缺損修復(fù)過程中的研究，可以為SDF-1 在局部骨再生修復(fù)的研究中提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)通過探討使用打磨機(jī)方法制造小鼠骨缺損模型，同時(shí)，對(duì)骨缺損局部SDF-1 進(jìn)行的持續(xù)的檢測(cè)，通過免疫組化的方法，獲得骨缺損發(fā)生后SDF-1 分泌動(dòng)態(tài)變化的過程。筆者發(fā)現(xiàn)，骨缺損發(fā)生后，缺損側(cè)局部的SDF-1 表達(dá)所有時(shí)相對(duì)比健側(cè)均有持續(xù)性的增高。說明骨缺損發(fā)生后，局部SDF-1 出現(xiàn)持續(xù)高水平分泌。由此可見，SDF-1 作為重要的趨化因子，在骨缺損修復(fù)過程中起到了非常重要的作用。

綜上所述，使用打磨機(jī)方法制造骨缺損，過程快速，可重復(fù)性好，大小范圍較傳統(tǒng)骨鉗易掌握且安全有效，為下一步研究提供了較好的動(dòng)物模型。在骨缺損發(fā)生后，局部SDF-1 分泌增加。SDF-1 在骨缺損修復(fù)過程的各時(shí)相點(diǎn)，均呈現(xiàn)較高表達(dá)，提示SDF-1 作為干細(xì)胞重要的趨化因子，在骨缺損修復(fù)中可能發(fā)揮著重要的作用。