代 潤，張 嬋，程瑜靜，陳婉璐，李 琦，王玉明

（1） 云南省第一人民醫(yī)院輸血科，云南昆明 650100；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650101）

隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，醫(yī)學(xué)知識(shí)、技術(shù)與科學(xué)數(shù)據(jù)正處于前所未有的融合階段，對(duì)患者治療方式的選擇就變得極其重要。個(gè)性化醫(yī)療正是基于這一點(diǎn)，綜合考慮每個(gè)患者的特點(diǎn)，選擇最適合個(gè)人的最佳治療方法。其范圍更加廣泛，包括藥物基因?qū)W、藥物基因組學(xué)等。其中，藥物基因組學(xué)是識(shí)別個(gè)體對(duì)特定藥物反應(yīng)中起作用的基因變異，包括劑量需求、療效和藥物不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的差異[1]。近年來，大量藥物基因組學(xué)研究主要集中在與藥物動(dòng)力學(xué)或臨床相關(guān)藥物的藥效學(xué)相關(guān)的VIPs（Very important drug genes） 上[2]，它們主要在藥物的吸收、分布、代謝、消除，以及藥物的分子靶點(diǎn)/通路中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3-4]。

目前人們對(duì)藥物基因組學(xué)不斷深入的研究，研究者發(fā)現(xiàn)與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因變異在不同的種族中是不同的[5-7]。中國是個(gè)人口大國，擁有56 個(gè)民族，其中，云南省是我國少數(shù)民族最多的省份，云南特有的少數(shù)民族中佤族約43 萬人口，布朗族約11 萬人口。雖然人類基因組計(jì)劃研究了全球人口樣本，但許多少數(shù)民族的藥物基因組學(xué)信息仍然是未知的。

筆者研究了云南佤族和布朗族VIP 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布，并且將佤族和布朗族分別和其他8 個(gè)種群進(jìn)行比較，以評(píng)估等位基因頻率的差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步完善藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫信息，了解藥代遺傳及其多樣性提供初步的依據(jù)，更好地了解佤族和布朗族人群的進(jìn)化歷程，為更安全的藥物給藥和今后云南省開展合理的個(gè)體化健康管理提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

從云南省隨機(jī)招募了200 名無親緣關(guān)系的健康人，其中佤族100 名，布朗族100 名。每個(gè)參與者都經(jīng)過了嚴(yán)格的調(diào)查，在三代以內(nèi)均是相同的種族，且無任何疾病。近年來雖然受漢族的影響較大，但是他們與其他民族之間的交流較少，仍然保持了各自民族獨(dú)特的特點(diǎn)。所有參與者對(duì)本研究的實(shí)驗(yàn)方案已知悉并簽署知情同意書，且該研究得到云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。另外，該研究方案符合衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（department of health and human services，DHHS） 關(guān)于人體研究課題保護(hù)的規(guī)定。

1.2 位點(diǎn)選擇和基因分型

筆者搜索了PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/） 并從中選取了40 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究。根據(jù)全血基因組DNA 純化試劑盒的說明書，筆者從參與者的血液中提取基因組DNA，采用NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

使用Agena MassARRAY 陣列設(shè)計(jì)軟件對(duì)單核苷酸多態(tài)性（SNP） 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[8]，并使用Agena MassARRAY RS1000 軟件進(jìn)行基因分型，最后用Agena Typer 4.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

此外，筆者使用Arlequin 軟件和Structure2.3.4軟件來觀察9 個(gè)民族的人群結(jié)構(gòu)。首先，在貝葉斯聚類算法的基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析，將樣本分配到假設(shè)的K 個(gè)種群內(nèi)。其中，每個(gè)個(gè)體都是由一個(gè)垂直的列來表示的，這些列被分割成不同的顏色部分。其次，F(xiàn)st 值是在種群和進(jìn)化遺傳學(xué)中應(yīng)用最廣泛的描述性統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用Arlequin 軟件分別完成了佤族和布朗族與其他8 個(gè)種族的Fst值的計(jì)算，以推斷群體中兩兩之間的距離。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 軟件于檢測(cè)每個(gè)VIP 位點(diǎn)的頻率是否符合哈德-溫伯格平衡定律，如符合，進(jìn)一步對(duì)佤族和布朗族進(jìn)行了VIP 位點(diǎn)的基因型頻率等檢測(cè)，并依據(jù)千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫分別將佤族和布朗族與其他8 個(gè)種族通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行基因型頻率比較，包括（1） 東亞： CHS（中國南方漢族），KHV（胡志明市越南人）；（2） 南亞：BEB（孟加拉國的孟加拉人）；（3） 歐洲：GBR（英格蘭和蘇格蘭人）；（4） 美國：CLM（哥倫比亞麥德林的哥倫比亞人）；（5） 非洲：ACB（在巴巴多斯的非洲加勒比海人），GWD（岡比亞西部地區(qū)的岡比亞人）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VIP 位點(diǎn)的基本信息

所選40 個(gè)VIP 位點(diǎn)（其中有10 個(gè)位點(diǎn)不符合哈德-溫伯格平衡定律，已將其剔除。） 在佤族和布朗族中的基本信息，包括SNP_ID 號(hào)、基因名稱、位置、核苷酸變化、功能變化、等位基因等，見表1。

2.2 佤族與其他8 個(gè)人群中的基因型頻率比較分析

佤族人群的基因型頻率分布和其他8 個(gè)人群的基因型頻率分布比較的p值結(jié)果如表2 所示。筆者發(fā)現(xiàn)，校正前，與中國云南布朗族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群體分別進(jìn)行比較，中國云南佤族分別有3，5，10，15，18，18，26，22 個(gè)不同的VIP 位點(diǎn)。Bonferroni 校正后，中國云南佤族分別有0，2，0，10，11，9，15，17 個(gè)不同的VIP 位點(diǎn)。VDR rs11568820（P=0.002，P=9.3E-06，P=1.0E-04，P=2.3E-04，P=9.3E-13，P=1.2E-13，P=1.1E-05 和P=4.7E-11） 和COMT rs4680（P=0.172，P=0.005，P=0.034，P=3.3E-09，P=1.8E-12，P=5.0E-06，P=4.2E-04 和P=0.026） 在中國云南佤族人群中表達(dá)較其他8 個(gè)群體有顯著差異。而rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6.4E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512 （P=2.1E-04） 的顯著性差異較小。

表1 VIP 位點(diǎn)的基本信息（1）Tab.1 The basic information of VIP variants（1）

2.3 布朗族與其他8 個(gè)人群中的基因型頻率比較分析

布朗族人群的基因型頻率分布和其他8 個(gè)人群的基因型頻率分布比較的P值結(jié)果如表3 所示。校正前，與中國云南佤族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群體分別進(jìn)行比較，中國云南布朗族分別有3，7，10，17，20，19，25，24 個(gè)不同的VIP 位點(diǎn)。Bonferroni 校正后，中國云南布朗族分別有0，4，1，11，11，11，16，18 個(gè)不同的VIP 位點(diǎn)。NR1I2 rs3814055 在中國云南布朗族人群中表達(dá)較其他8 個(gè)群體有顯著差異（P=0.004，P=7.3E-06，P=0.008，P=2.7E-09，P=9.0E-13，P=1.1E-14，P=2.9E-13，和P=2E-11），而 rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512（P=2.1E-04） 的顯著性差異較小。

表1 VIP 位點(diǎn)的基本信息（2）Tab.1 The basic information of VIP variants （2）

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步鑒定9 個(gè)群體之間的祖先群體關(guān)系，筆者利用基于結(jié)構(gòu)計(jì)算的基于模型的聚類方法進(jìn)行了分析（K=3-9），如圖1 所示。隨著K 值的增加，亞組間的差異更加明顯。而K=3 被認(rèn)為是最適當(dāng)?shù)闹担梢詫⑦@些個(gè)體明確地分為三個(gè)祖先亞群，分別為：亞組1（中國云南布朗族、中國云南佤族、CHS、KHV），亞組2（BEB、GBR、CLM），亞組3（ACB、GWD）。結(jié)果表明，東亞地區(qū)的布朗族、佤族、CHS、KHV 人群的遺傳結(jié)構(gòu)相似，此結(jié)果在表1 中得到了證實(shí)。

表2 佤族與其他8 個(gè)人群中的基因型頻率比較分析Tab.2 The comparative analysis of genotype frequency between Wa and other 8 populations

基于遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用兩兩配對(duì)的Fst 值來評(píng)價(jià)9 個(gè)群體之間的遺傳關(guān)系（表4）。從表4中發(fā)現(xiàn)，中國云南布朗族、中國云南佤族與東亞地區(qū)的CHS、KHV 人群的Fst 值較小。Fst 值越小，人群遺傳結(jié)構(gòu)越相似。結(jié)果表明，布朗族與佤族的關(guān)系最接近（Fst=0.003），其他種群次之。

3 討論

近年來發(fā)展的藥物基因組學(xué)通過關(guān)聯(lián)患者個(gè)體的遺傳物質(zhì)與藥物的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)特性，可以幫助醫(yī)師、藥師預(yù)測(cè)藥物療效、估算藥物劑量、調(diào)整給藥方案以及預(yù)防藥物不良反應(yīng)發(fā)生，指導(dǎo)個(gè)體化合理用藥[9]。云南地區(qū)針對(duì)少數(shù)民族基因多態(tài)性的研究主要關(guān)于STR 基因座[10]，對(duì)藥物基因的多態(tài)性研究并不多見，朱柯穎等[11]人對(duì)云南彝族人群CYP4A11 rs9333025 基因A/G 多態(tài)性的分布進(jìn)行過研究。在本次研究中，筆者對(duì)中國云南佤族和布朗族人群的VIP 位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型和等位基因頻率分布檢測(cè)，并將中國云南佤族和中國云南布朗族分別和其他8 個(gè)種群進(jìn)行比較，對(duì)等位基因頻率的差異進(jìn)行了評(píng)估。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，云南佤族與東亞地區(qū)的布朗族、CHS、KHV 的差異較小，而與其他地區(qū)的人群差異較大，尤其是非洲地區(qū)的人群。云南佤族與其他8 個(gè)人群比較，最為顯著的位點(diǎn)是VDR rs11568820 和COMTrs4680。云南布朗族與東亞地區(qū)的佤族、CHS、KHV 的差異最小，而與南亞、歐洲、美國、非洲地區(qū)的人群差異較大，尤其是非洲地區(qū)的人群。布朗族與其他8 個(gè)人群比較，最為顯著的位點(diǎn)是NR1I2 rs3814055，此結(jié)果與筆者以前的研究結(jié)果一致[12]。

表3 布朗族與其他8 個(gè)人群中的基因型頻率比較分析Tab.3 The comparison and analysis of genotype frequency between Blang and other 8 populations

圖1 9 個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Genetic structure analysis of 9 populations

表4 9 個(gè)種群的Fst 值Tab.4 Fst values among 9 populations

VDR（Vitamin D （1，25-dihydroxyvitamin D3） receptor，維生素D 受體） 基因定位于染色體12q13.11，是維生素D 途徑的重要調(diào)控因子，在該基因中發(fā)現(xiàn)了許多常見的SNP 位點(diǎn)。Rs11568820位于VDR 基因的5' 調(diào)節(jié)區(qū)域，rs11568820 等位基因A 被Rowland 等人發(fā)現(xiàn)侵襲性前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[13]。一項(xiàng)由衛(wèi)生專業(yè)人員進(jìn)行的隨訪研究指出，25（OH） D 缺乏與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，而Mikhak 等[14]發(fā)現(xiàn)，攜帶rs11568820 位點(diǎn)A 等位基因的男性，如果缺乏25（OH） D 基因，那么其患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)將顯著降低。這些趨勢(shì)上的差異可能是由于種族差異造成的，因?yàn)檠芯渴窃谒忻绹行缘娜巳褐羞M(jìn)行的，而衛(wèi)生專業(yè)人員的后續(xù)研究主要在歐洲男性人群中進(jìn)行的。

COMT（Catechol-O-methyltransferase，兒茶酚-鄰甲基轉(zhuǎn)移酶） 是一種重要的雌激素代謝物結(jié)合失活的雌激素代謝酶[15]，由位于22q11 號(hào)染色體上的COMT 基因編碼。COMT 在多種人體組織中的表達(dá)量都很高，包括卵巢、乳腺、肝臟和腎臟組織。近日，有研究者發(fā)現(xiàn)，COMT rs4680 上的單個(gè)堿基的改變導(dǎo)致纈氨酸替代了蛋氨酸，被認(rèn)為是使COMT 活性降低了3-4 倍的原因[16]。近年來這種酶被發(fā)現(xiàn)在受激素影響的癌癥的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，例如，乳腺癌[17-19]，。Wan 等人的一項(xiàng)薈萃分析表明，COMT rs4680 位點(diǎn)可能會(huì)增加中國人群乳腺癌的易感性，特別是在絕經(jīng)前的婦女人群中[18]。Lin 等人在總體分析中發(fā)現(xiàn)COMT rs4680 多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)無顯著相關(guān)性，但在GA/GG 和（AA+GA）/GG 遺傳模型下，絕經(jīng)后婦女人群中發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低[17]。He 等[19]的研究表明COMT 基因多態(tài)性與降低白種人乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而與其他人群無關(guān)。這些結(jié)果可能提示絕經(jīng)狀態(tài)和種族差異對(duì)COMT rs4680 多態(tài)性與激素相關(guān)癌癥（包括卵巢癌） 的相關(guān)性有重要影響。

NR1I2（Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2） 屬于核激素受體超家族，其主要作用是作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)藥物和有毒外源性藥物的解毒和清除。Rs3814055 定位于NR1I2 的5’非翻譯區(qū)，在疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)和藥物基因組學(xué)方面均已經(jīng)引起了許多研究者的關(guān)注。大量研究表明，NR1I2 基因中rs3814055 的頻率在不同人群中是不同的。在中國漢族人群中該位點(diǎn)的頻率為0.218[5]，歐洲人為0.500[20]。有研究發(fā)現(xiàn)在珞巴族和苗族中該位點(diǎn)的T等位基因的頻率分別是0.101 和0.090[6-7]。在本研究中佤族和布朗族中rs3814055 的T 等位基因的頻率分別是0.840 和0.060。以上的研究再一次充分說明了等位基因頻率的分布受到了種群的影響。希望筆者的數(shù)據(jù)能夠補(bǔ)充藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫。

藥物基因?qū)W和藥物基因組學(xué)知識(shí)庫（PharmGKB:http://www.pharmgkb.org） 是解釋基因-藥物-疾病關(guān)系的極其有用的資源，擬在揭示這些遺傳變異與藥物反應(yīng)之間的關(guān)系，為患者提供最合適的藥物類型和準(zhǔn)確的最佳劑量指導(dǎo)，從而提高藥物的療效和安全性，是開發(fā)個(gè)性化藥物和患者藥物管理的重要基礎(chǔ)。然而，種族對(duì)藥物反應(yīng)的差異很大，目前部分少數(shù)民族相關(guān)的研究還不夠充分。希望本研究的數(shù)據(jù)能夠補(bǔ)充佤族和布朗族的藥物基因組學(xué)信息，為其更安全的用藥以及新藥的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，并為個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展提供一些幫助。