王家偉 易登良 王濤 高毅濱

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2瀘州市人民醫(yī)院心內(nèi)科)

黃芩為唇形科多年生草本植物,根入藥,是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、瀉火清心、涼血活血等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明〔1～3〕，黃芩具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、免疫抑制、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。黃芩素是從黃芩的干燥根中分離得到的一類黃酮類化合物，也是黃芩的主要活性成分。多項(xiàng)研究表明〔4～6〕，黃芩素對(duì)心血管具有良好的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)心肌缺血再灌注(I/R)損傷有保護(hù)作用，由于I/R損傷病理機(jī)制復(fù)雜，黃芩素對(duì)I/R損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制并非缺乏深入研究。近年來Janus激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活分子(STAT)被證實(shí)參與人體內(nèi)病理生理反應(yīng),在多種疾病的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用〔7〕。JAK/STAT信號(hào)通道也參與I/R損傷的病理過程，過度激活的JAK-STAT信號(hào)通路也會(huì)引起相關(guān)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-6水平的變化及相關(guān)調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的變化〔8〕。本研究制備大鼠冠脈左前降支結(jié)扎釋放的I/R損傷模型，觀察黃芩素對(duì)I/R損傷的保護(hù)作用，并通過觀察相關(guān)指標(biāo)的變化探討其對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 50只SPF級(jí)SD雄性大鼠，4周齡，體重220～260 g，平均(245.0±10.4)g，選于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(京)2012-0001。在溫度22～25℃及相對(duì)濕度55%～60%條件下飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，自由攝食飲水。

1.2藥物、試劑及主要儀器 黃芩素由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，CAS號(hào)：491-67-8，實(shí)驗(yàn)前配制成所需濃度溶液使用；AnnexinV-FITC/PI，德國(guó)Roche公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)染料，北京索萊寶生物科技有限公司， 批號(hào)為 20180202；IL-6、IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；Bax、Bcl-2抗體、抗人磷酸化(p)-JAK2抗體、抗人p-STAT3抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；MeditecAG雙目顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；MULTISKANMK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；離心機(jī)型，德國(guó)Eppendorf型；ChemiDocTMXRS+凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3動(dòng)物分組及給藥 50只大鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(C)組、假手術(shù)對(duì)照(S)組、模型(IR)組、黃芩素低劑量(L)組和黃芩素高劑量(H)組，每組10只。C組、S組、IR組給予生理鹽水2 ml/d連續(xù)7 d腹腔注射；L組給予黃芩素0.4 mg/(kg·d)(0.4 mg黃芩素粉溶解于2 ml生理鹽水)連續(xù)7 d腹腔注射，H組給予黃芩素1.2 mg/(kg·d)(1.2 mg黃芩素粉溶解于2 ml生理鹽水)腹腔注射7 d，IR組、H組、L組再連續(xù)注射7 d。C組不做處理，S組行假手術(shù)處理，IR組、H組、L組進(jìn)行大鼠I/R模型制備。

1.4I/R模型制備 S組、IR組、H組、L組連續(xù)注射7 d,末次給藥后30 min，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》〔9〕建立大鼠I/R模型，首先對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，采用仰臥位固定至手術(shù)臺(tái)，氣管插管，連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)和心電圖儀。用醫(yī)用酒精進(jìn)行胸部消毒，從胸骨左側(cè)第3～4肋間水平橫行切口，逐層分離組織，打胸腔及心包膜，向右上方暴露心臟，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間分離出冠狀動(dòng)脈左前降支，于左心耳下緣2 mm處穿線對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎(S組只穿線不結(jié)扎)，形成活結(jié)，同時(shí)活結(jié)放置軟管，拉緊活結(jié)阻斷冠脈左前降支供血，以心電圖出現(xiàn)ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎40 min后輕輕打開活結(jié)扎線，以心電圖出現(xiàn)ST段抬高斷下降為復(fù)灌成功標(biāo)志，恢復(fù)血液灌注90 min后，即為大鼠I/R損傷模型。

1.5TTC法評(píng)價(jià)心肌梗死率 復(fù)灌90 min后取心臟，用4℃生理鹽水清洗干凈，用吸水紙吸去水分，剪取心室并稱其質(zhì)量，將心室從心尖至心底切成1.0～2.0 mm組織切片，置于1% TTC磷酸緩沖溶液，于37℃條件染色5 min。梗死心肌呈白色，非梗死心肌為深紅色，將壞死區(qū)與非壞死區(qū)分離，稱取白色部分質(zhì)量。得出心肌梗死率，心肌梗死率=蒼白區(qū)質(zhì)量/心室質(zhì)量×100%。

1.6血清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平的測(cè)定 在造模前及再灌90 min后由腹主動(dòng)脈各取血2 ml，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，按照ELISA操作及試劑盒說明書，測(cè)定造模前及復(fù)灌90 min后血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量水平。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3基因表達(dá) ①心肌細(xì)胞總RNA提取;②逆轉(zhuǎn)錄;③PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃ 45 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，循環(huán)40次；以β-actin 為內(nèi)參照，用2-△△Ct法獲得心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3基因mRNA相對(duì)水平。各基因引物擴(kuò)增序列：β-actin上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,Bax:上游:5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′,下游:5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′;Bcl-2上游5′-CCGGGAGATCGTGATGAAGT-3′,下游:5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′;JAK2上游:5′-AAGCATGTGGTATTACGCCTGTG-3′,下游:5′-CCTGGTTGACTCATCTATGTGGAAG-3′;STAT3上游:5′-GAGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3′,下游:5′-CAGGTCGTTGGTGTCACACA-3′。

1.8心肌組織中Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平測(cè)定 取各組心肌組織，用裂解液將組織裂解，組織勻漿器攪勻，37℃孵育5 min，12 000 r/min離心10 min。收集細(xì)胞并抽提蛋白，以二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法檢測(cè)總蛋白濃度，取50 μg蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上，5%BSA的TBST封閉2 h，分別加入一抗鼠抗人Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯色，用凝膠掃描系統(tǒng)曝光及圖片掃描成像，以 β-actin 為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Image J分析軟件計(jì)算分析，獲得各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TTC 法測(cè)定黃芩素對(duì)大鼠I/R心肌梗死率的影響 染色結(jié)果顯示，壞死心肌呈灰白色，非壞死區(qū)心肌呈深紅色，C組和S組未見灰白色壞死心肌，IR組、H 組、L組出現(xiàn)大小不等的灰白色壞死心肌，進(jìn)一步表明造模成功;通過對(duì)梗死面積的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，H 組、L組灰白色壞死心肌均明顯減少(P<0.05); H組比L 組作用更明顯(P<0.05)。因此，黃芩素可顯著降低I/R損傷大鼠的心肌梗死率(P<0.05)，見圖 1，表1。

圖1 各組心肌梗死面積(×50)

表1 各組心肌梗死率比較

與S組比較:1)P<0.05；與IR組比較:2)P<0.05；與L組比較:3)P<0.05；同表3，表4

2.2各組血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平比較 造模前，各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與S組比較，IR組、L組、H組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增加(P<0.05)；與IR組比較，L組、H組血清中IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，而黃芩素對(duì)IL-1β細(xì)胞因子無顯著影響；與L組比較，H組TNF-α及IL-6水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

組別時(shí)間IL-6IL-1βTNF-αC組未處理11.42±2.9529.77±2.2024.93±2.02S組假手術(shù)前10.66±2.8928.30±2.0125.78±2.0690 min11.45±3.3027.02±1.5023.63±1.83IR組造模前12.78±2.3628.65±1.5824.66±2.3090 min345.38±98.711)2)45.44±2.291)2)173.45±50.291)2)L組造模前12.36±3.3428.02±3.0623.78±2.5490 min288.37±65.301)2)3)47.48±3.301)2)116.23±43.301)2)3)H組造模前10.39±2.8129.66±2.4426.45±3.0290 min218.65±57.251)2)3)4)48.69±2.791)2)96.69±28.421)2)3)4)

與造模前比較:1)P<0.05；與S組比較:2)P<0.05；與IR組比較:3)P<0.05；與L組比較:4)P<0.01

2.3各組心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax、JAK2和STAT3基因表達(dá) C組與S組Bcl-2、Bax、JAK2和STAT3基因mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IR組、L組、H組心肌細(xì)胞中Bax、JAK2和STAT3基因mRNA均顯著高于S組，而Bcl-2基因mRNA顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，L組、H組Bax、JAK2和STAT3基因mRNA表達(dá)量顯著低于IR模型組(P<0.05)，而H組Bcl-2基因mRNA顯著高于IR組，見表3。

組別Bcl-2 mRNABax mRNAJAK2 mRNASTAT3 mRNAC組2.03±0.100.59±0.090.30±0.120.43±0.10S組2.12±0.110.61±0.100.29±0.110.41±0.10IR組0.81±0.091)2.65±0.281)1.80±0.191)2.77±0.281)L組0.79±0.081)2)2.57±0.271)2)1.61±0.181)2)2.57±0.251)2)H組1.21±0.071)2)3)1.95±0.211)2)3)1.51±0.071)2)2.45±0.231)2)3)

2.4各組心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)比較 C組與S組Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IR組、L組、H組與S組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降，Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；L組、H組Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)量顯著低于IR組(P<0.05)，而H組Bcl-2蛋白顯著高于IR組(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)比較

組別Bcl-2/β-actinBax/β-actinp-JAK2/β-actinp-STAT3/β-actinC組2.48±0.300.56±0.090.25±0.120.28±0.13S組2.55±0.220.54±0.100.20±0.090.25±0.10IR組0.95±0.091)2.41±0.181)1.81±0.191)2.39±0.191)L組0.94±0.081)1.92±0.171)2)1.35±0.151)2)1.56±0.171)2)H組1.58±0.071)2)3)1.71±0.171)2)3)1.21±0.111)2)3)1.41±0.141)2)3)

3 討 論

隨著現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展與人民生活方式的轉(zhuǎn)變，我國(guó)疾病譜也在逐漸發(fā)生變化。調(diào)查顯示〔10〕，近十年來，心血管病已成為我國(guó)城鄉(xiāng)居民的第1位死因，其死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)45%。其中，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重的心肌梗死頻發(fā)，死亡率上升，由于缺乏較好的治療方法與技術(shù)〔11,12〕，目前，需要一種安全有效的治療技術(shù)及藥物〔13〕。臨床治療急性心肌梗死常用緊急溶栓、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)及護(hù)理康復(fù)訓(xùn)練等治療方法〔14～16〕，以恢復(fù)血流供應(yīng)，從而確保缺血組織再供血，及時(shí)挽救缺血組織，然而若缺乏及時(shí)治療，極易導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡壞死、心功能障礙及惡性心律失常損傷，即I/R損傷。心肌一旦損傷，微血管阻塞，即使血管再通，缺血組織的微循環(huán)血流也不能完全恢復(fù)，即無復(fù)流現(xiàn)象，這些無復(fù)流是造成心絞痛、惡性心律失常和心源性死亡的關(guān)鍵因素。因此，研究心臟再灌注損傷機(jī)制和心肌保護(hù)是當(dāng)今諸多學(xué)者研究追蹤的熱點(diǎn)〔17～19〕。

缺血再灌注損傷病理機(jī)制復(fù)雜，涉及多種病理生理過程，如能量代謝障礙、鈣超載、氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、自噬、血管無復(fù)流現(xiàn)象〔20～22〕等。其中有多種細(xì)胞機(jī)制、細(xì)胞通路和細(xì)胞因子參與:ATP敏感鉀通道(KATP)、基質(zhì)金屬酶(MMPs)、Fas 信號(hào)通路、血管緊張素(ANG)Ⅱ、Toll樣受體、磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)、JAK-STAT信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)、核因子(NF)-κB、細(xì)胞因子，如IL、干擾素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、生長(zhǎng)激素(GH)等〔23〕，這些信號(hào)與心臟細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。其中JAK-STAT途徑越來越多被證明是細(xì)胞缺血再灌注損傷中引起凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵所在〔24〕。JAK蛋白是一類非跨膜型的酪氨酸激酶，目前發(fā)現(xiàn)JAK家族共有4個(gè)成員:JAK1、JAK2、JAK3及Tyk2。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活過程中STAT發(fā)揮了關(guān)鍵性作用〔25〕。在細(xì)胞病理生理過程中，當(dāng)細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合時(shí)引起受體分子的二聚化，激活與受體耦聯(lián)的JAK，進(jìn)而活化STAT蛋白，活化的JAK-STAT信號(hào)作為信號(hào)載體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中，一種細(xì)胞因子的信號(hào)通路也可以激活多個(gè)JAK，一種JAK可以參與多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)過程。機(jī)體中過度激活的JAK-STAT信號(hào)通路將會(huì)引起相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平的變化及相關(guān)調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)的蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)I/R造成對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的激活，而黃芩素能夠部分抑制JAK-STAT信號(hào)通路的激活。I/R損傷造成血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平升高，也導(dǎo)致心肌細(xì)胞Bax基因表達(dá)升高，Bcl-2基因表達(dá)降低，而黃芩素處理大鼠對(duì)TNF-α、IL-6、Bax、Bcl-2指標(biāo)均有影響。王慶高等〔26〕研究表明，JAK-STAT信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)具有明顯的相關(guān)性， JAK-STAT信號(hào)通路與炎癥因子的具體影響機(jī)制及黃芩素對(duì)大鼠I/R損傷具有保護(hù)作用是否通過抑制JAK-STAT信號(hào)通路造成有待進(jìn)一步研究。此外，有研究表明〔27〕，黃芩素具有通過抑制過表達(dá) LncRNA AK021954 基因從而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖；呂巖等〔28〕研究表明，黃芩素可通過抗氧化、減少心肌酶的漏出機(jī)制對(duì)大鼠I/R損傷有保護(hù)作用；李爽等〔29〕研究表明，黃芩素通過抗氧化和抗凋亡兩種機(jī)制對(duì)大鼠I/R損傷有保護(hù)作用?？傊S芩素對(duì)大鼠I/R損傷保護(hù)作用具有多靶點(diǎn)和多機(jī)制作用。

綜上，黃芩素對(duì)大鼠I/R損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制JAK-STAT信號(hào)通路過度激活從而產(chǎn)生對(duì)大鼠I/R損傷的保護(hù)作用。由于本研究?jī)H初步對(duì)黃芩素藥理作用進(jìn)行研究，其進(jìn)一步的藥理作用機(jī)制及病理毒理學(xué)影響有待深入研究。