耿元文 林琴琴 王湘怡 李若明 田振軍

摘 要：目的：探討間歇運動激活心梗 （myocardial infarction， MI） 大鼠腎臟miR-34a/SIRT1/Trx-1通路抑制腎臟氧化應激反應改善腎臟功能的作用。方法：3月齡雄性SD大鼠，隨機分為假手術組 （Sham）、心肌梗死組 （MI）和心梗+間歇有氧運動組（ME），每組12只。MI組采用心臟左冠狀動脈前降支 （LAD） 結扎法建立MI模型。Sham組大鼠實施假手術，ME 組大鼠在MI 手術后1周進行4周跑臺運動。ME組適應性訓練1周 （10～15 m/min，30 min/d，共5 d）。正式訓練起始速度10 min×10 m/min （40%～50% VO2 max） 熱身，以7 min×25 m/min（85%～90% VO2 max） 和3 min×15 m/min （ 50%～60% VO2 max）交替進行大中等強度間歇運動?？倳r間為60 min，每周訓練5 d，連續(xù)訓練4 w。訓練結束后次日取材，測定各組大鼠心電圖變化，采用紫外分光光度法測定腎臟MDA含量、T-AOC和GSH-Px活性，ELISA法測定腎臟LDH活性、血清Trx-1水平以及血清和尿液NAG水平，RT-qPCR 檢測腎臟miR-34a和Trx-1表達變化，Western Blot 檢測腎臟SIRT1、SOD1、SOD2、NOX2和NOX4蛋白表達。結果：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟MDA含量和LDH活性顯著增加，T-AOC和GSH-Px活性顯著降低;腎臟miR-34a表達顯著增加，SIRT1、SOD1和SOD2表達顯著減少，NOX2和NOX4表達顯著增加;腎臟Trx-1 mRNA表達增多，血清Trx-1水平升高，血清及尿液NAG表達顯著升高。與MI組比較，間歇運動顯著降低MI大鼠腎臟MDA含量和LDH活性，增加T-AOC和GSH-Px活性，上調SIRT1、SOD1、SOD2和Trx-1的表達，抑制NOX2、NOX4和miR-34a表達，降低血清及尿液NAG表達。血清 Trx-1與NAG表達呈顯著正相關;腎臟SIRT1蛋白表達與NOX2、NOX4、MDA和LDH表達呈顯著負相關;與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著正相關。腎臟miR-34a表達與SIRT1表達呈顯著負相關， 與MDA和LDH蛋白表達呈顯著正相關，與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著負相關。結論：間歇運動抑制MI大鼠腎臟miR-34a表達，激活其下游SIRT1/Trx-1調控的NOX4信號通路。表明，miR-34a/SIRT1/Trx-1信號通路在間歇運動抑制心梗大鼠腎臟氧化應激中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：間歇運動; 心肌梗死; 氧化應激; miR-34a; SIRT1

中圖分類號：G804.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2020）06-0044-10

Abstract： Objective：To determine the effects of aerobic interval training （AIT） on the expressions of microRNA-34a （miR-34a）， SIRT1 and Trx-1 and renal oxidative stress in rats with myocardial infarction （MI）. Methods：male Sprague Dawley rats were randomly divided into Sham-operated group （Sham）， Sedentary MI group （MI） and MI with AIT group （ME） （n=12）. The MI model was established by ligation the left anterior descending coronary artery（LAD）. Rats in ME were subjected to 8 weeks treadmill exercise training. （AIT：60 min/day with 10 min of warm-up at 10 m/min （40%～50%VO2 max） and 50 min of exercise at 25 m/min 7 min （85%～90% VO2 max） interspersed with 3 min at 15 m/min （ 50%～60% VO2 max））. After training renal function was evaluated. The levels of renal MDA content， T-AOC and GSH-Px activity by ultraviolet spectrophotometry. The activity of LDH in renal was determined by microplate assay. The levels of serumrx-1and serum， urine NAG were assessed by ELISA. The expression of renal miR-34a， Trx-1 was examined by RT-q PCR. The expression of renal SIRT1 protein was examined by western blotting. Results：Compared with the Sham group， MI increased the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1， serum and urine NAG， and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， MI inhibited the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1 and SOD2. Compared with the MI group， AIT inhibited the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， serum and urine NAG and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， AIT up-regulated the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1， SOD2 and renal Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1. The serum level of Trx-1 was positively related to the level of NAG. The expression of SIRT1 protein was negatively related to the expression of NOX2， NOX4， MDA and LDH， and positively related to the xpression of SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px. The expression of miR-34a was negatively related to the expression of SIRT1， SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px protein， and positively related to the expression of MDA and LDH. Conclusion：AIT inhibits the level of renal miR-34a， activates the downstream SIRT1/Trx-1 regulated NOX4 signaling pathway. It shows that the miR-34a/ SIRT1/Trx-1 signaling pathway plays an important role in the inhibition of AIT on oxidative stress in the kidneys of rats with myocardial infarction.

Key words： aerobic interval training; myocardial infarction; oxidative stress; miR-34a; SIRT1

眾所周知，心肌梗死（myocardial infarction，MI）心輸出量減少，腎臟血流連續(xù)減少，誘發(fā)腎臟氧化應激和炎癥反應[1～2]，導致急性腎臟損傷（acute kidney injury，AKI），繼發(fā)腎功能紊亂。研究證實，氧化應激是AKI的主要決定因素，氧化應激水平升高與NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX） 活化有關，其是生成活性氧的主要酶體[3]。NADPH氧化酶家族有7種亞型，分別是NOX1-5以及2種雙氧化酶DUOX-1和DUOX-2，其中NOX4是腎臟中的主要形式，NOX2也同時表達[4]。研究發(fā)現(xiàn)，NOXs上調表達在腎臟氧化應激和腎臟損傷中發(fā)揮重要作用[5]，腎臟缺血缺氧誘發(fā)NOX2和NOX4表達增加，氧化應激增強，細胞凋亡增多，而抑制NOX4表達可顯著減少腎臟缺血導致的氧化應激和細胞凋亡，減緩腎臟損傷[6]。 提示，NOX4是腎臟氧化應激損傷進程的重要靶點。大量研究證實，有氧運動增強抗氧化能力并減弱正常及疾病大鼠腎臟氧化應激[7-8]。有氧運動可顯著減少MI大鼠腎臟脂質過氧化，增強腎臟抗氧化能力[7]，減輕高鹽飲食引起的腎臟氧化應激[8]。另有研究證實，間歇運動較有氧運動更有效保護腎臟功能[9-10]。但間歇運動是否抑制MI大鼠腎臟NOX4表達，抑制腎臟氧化應激，目前尚無文獻報道。

研究證實，多種生物分子和信號通路影響氧化應激。microRNAs（miRs）通過抑制mRNA轉錄或促進mRNA降解，成為許多生物進程的調節(jié)者[11]，其作為信號分子參與腎臟損傷發(fā)生機制與病理生理過程。體內外研究證實，腎臟損傷后miR-27a-3p和miR-320等表達水平與腎臟氧化應激水平同步上調，抑制其表達可顯著減輕腎臟氧化應激反應，減少腎臟損傷[12-13]。提示，miRs可作為腎臟疾病的生物標記物和/或潛在治療靶點。miR-34家族成員miR-34a在氧化應激[14]、炎癥[15]和細胞凋亡[16]中起重要作用，且證實直接靶向NAD +依賴性核III類組蛋白去乙?；竤irtuin 1（SIRT1）[17]。已知SIRT1通過去乙?；蚺c幾種靶蛋白相互作用來抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡而發(fā)揮腎臟保護作用[18]。體內外實驗研究證實，腎毒性大鼠、小鼠及腎臟細胞中miR-34a表達增加，SIRT1表達降低，氧化應激水平升高[19]。另研究證實，硫氧還蛋白-1 （Thioredoxin-1， Trx-1），一種具有氧化還原/炎癥調節(jié)特性且普遍存在的硫醇蛋白，通過抑制氧化應激保護代謝綜合征心血管功能[20]和橫紋肌溶解相關急性腎損傷的腎臟功能[21]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1上調表達顯著增加衣霉素誘導近端腎小管細胞和內質網(wǎng)應激小鼠腎小管中Trx的表達，抑制腎臟氧化應激[22]。表明，miR-34a/ SIRT1介導的Trx-1信號傳導是控制腎臟氧化應激的重要途徑。研究證實，運動通過調控miRs表達參與腎臟生理病理進程[23-24]。但運動是否激活MI腎臟miR-34a/SIRT1/Trx-1信號通路，抑制氧化應激反應，保護腎臟功能，目前尚無文獻報道。因此，本研究擬探討間歇運動對MI大鼠腎臟miR-34a和氧化應激的影響及其可能機制，為運動改善MI的病理進程及其機制探討和相關治療靶點篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要試劑：TRIzol（購于Inventragtion）、反轉錄試劑盒（購于TAKARA）、兔抗多克隆抗體SIRT1（購于Bioworld）、兔抗單克隆抗體超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 1、SOD2、NOX2和NOX4（購于Abcam）、PCR引物（購于上海生工）、ELISA試劑盒（購于美國R&D公司）、氧化應激試劑盒丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（購于南京建成生物科技有限公司）等。

主要儀器： PowerLab 8/30生理信號采集系統(tǒng)、Bio-Rad電泳儀和轉移槽、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)、BX51奧林巴斯光學顯微鏡、Thermo低溫高速離心機、尼康熒光顯微鏡、Bio-Rad PCR擴增儀等。

1.2 動物分組與MI模型制備

動物分組：3月齡雄性SD大鼠36只 （購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物質量合格證號：陜醫(yī)動證字SCXK2012-098），體重180～220 g，國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食。動物室內溫度為20℃～29℃，濕度為50%～60%。動物隨機分為假手術組 （Sham組）、心肌梗死組 （MI組）和心梗+間歇有氧運動組 （ME組），每組12只。Sham組大鼠常規(guī)籠內安靜飼養(yǎng)，MI 組采用左冠狀動脈前降支 （ LAD） 結扎法，制備MI 模型。ME 組進行為期4周的小動物跑臺運動。

MI模型制備：5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用大鼠呼吸面罩進行呼吸機輔助呼吸 （60次/min，潮氣量16 mL，呼吸比1∶2），多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄大鼠肢導心電圖 （ECG）。開胸暴露心臟，于左心耳根部和肺動脈圓錐左緣交界下2 mm 處用5/0手術線結扎左冠狀動脈前降支（LAD），結扎后肉眼可見結扎遠端心肌顏色逐漸變淺或變白，主要局限在LV，靠近心尖部最為明顯。利用心電圖監(jiān)測評價MI模型，大鼠MI 后心電圖出現(xiàn)S-T段抬高或T波倒置現(xiàn)象。由此斷定MI模型造模成功。然后逐層縫合關胸。為了排除手術因素干擾，Sham組大鼠手術過程同上，但僅穿線而不結扎LAD。ME組大鼠在MI模型成功后1 周開始訓練。

1.3 間歇有氧運動方案

運動方案參考Wisloff訓練模型[25]。ME組大鼠術后1周進行跑臺運動。適應性訓練1周 （10～15 m/min，30 min/d，共5 d）。正式訓練起始速度10 min×10 m/min （40%～50%VO2max） 熱身，以7 min×25 m/min（85%～90% VO2max） 和3 min×15 m/min（50%～60%VO2 max）交替進行大中等強度間歇運動?？倳r間為60 min，每周訓練5 d，連續(xù)訓練4 w。上述運動方案無大鼠死亡。

1.4 樣本處理及生化指標測定

4周運動結束后次日，測定心電圖，腹主動脈取血及膀胱取尿后，迅速摘取腎臟，液氮驟冷，轉移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血液及尿液樣本離心后棄沉淀留取上清液，嚴格參照試劑盒說明對腎臟MDA、LDH、T-AOC、GSH-Px進行測定;運用ELISA法，嚴格按照試劑盒（R&D公司）操作步驟對血清Trx-1及血清和尿液中N-乙酸-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glucosaminidase， NAG）的含量進行測定。

1.5 Western Blot

采用RIPA提取腎臟總蛋白質，Bradford法測定蛋白濃度。10～12% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后，轉至PVDF膜，3% BSA室溫搖床封閉1 h后，分別加入兔抗多克隆抗體SIRT1 （1∶400）、兔抗單克隆抗體SOD1（1∶50 000）、SOD2（1∶5000）、NOX2（1∶5000）、NOX4（1∶5000），4℃過夜，室溫復溫30 min后，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗抗體 （1∶10 000） 孵育1 h，TBST清洗，ECL發(fā)光。內參為GAPDH （1∶8000）。

1.6 RT-qPCR

用TRIzol試劑提取腎臟總RNA，嚴格按照反轉錄試劑盒說明書操作步驟反轉錄合成cDNA，后進行RT-qPCR反應，內參為GAPDH。引物序列如下：Trx-1上游引物：5′-CTG ATCGAGAGCAAGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCA AGGAACACCACATTGGA-3′，擴增產(chǎn)物長度為158 bp;GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAA CAGGGT GGT GGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，擴增產(chǎn)物為252 bp。反應條件如下：95℃ 10 min，1 循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循環(huán);72℃ 10 min。每個樣品重復檢測3次。利用2-△△Ct法計算相對基因表達量。

用TRIzol試劑提取腎臟總RNA，按microRNA反轉錄試劑盒說明書方法反轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板按PCR試劑盒進行PCR反應。引物和探針由寶生物工程有限公司（TaKaRa）設計和合成，U6為內參。反應條件如下：95℃ 30 s，1 個循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 20 s，39 個循環(huán)。每個樣品重復檢測3次。利用2-△△Ct法計算miR-34a的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均運用采用SPSS 17.0 for Windows統(tǒng)計軟件對所獲得的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 （x[TX-*4]±s）表示。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析 （one-way analysis of variance， ANOVA）。顯著性差異選擇P<0.05和P<0.01水平。

2 研究結果與分析

2.1 間歇運動顯著改善心梗大鼠心功能

心電圖結果顯示：間歇運動前假手術組大鼠心電圖正常，P、Q、R、S、T 各波段規(guī)則;心梗手術后大鼠心電圖出現(xiàn)S-T 段抬高或T 波倒置現(xiàn)象，由此斷定MI 模型造模成功;間歇運動后ME 組大鼠心電圖趨于正常，表明間歇運動對心梗大鼠是安全有效的，具有保護作用，且顯著改善心功能（圖1）。

2.2 間歇運動顯著抑制心梗大鼠腎臟miR-34a的表達

RT-qPCR結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟miR-34a表達顯著增加 （P<0.01）;與MI組比較，ME組腎臟miR-34a表達顯著減少 （P<0.01）。表明心梗大鼠腎臟組織miR-34a表達升高，間歇運動干預可明顯抑制腎臟組織miR-34a表達（圖2）。

2.3 間歇運動顯著增加心梗大鼠腎臟SIRT1的表達

Western blot結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟SIRT1表達顯著減少 （P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠腎臟SIRT1表達顯著增加 （P<0.01）（圖3）。

2.4 間歇運動顯著增加心梗大鼠血清及腎臟Trx-1的表達

ELISA結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟Trx-1 mRNA表達增多，血清Trx-1水平升高 （均為P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠腎臟Trx-1 mRNA表達增多，血清Trx-1水平升高（均為P<0.01）。這表明心梗大鼠腎臟組織Trx-1應激性升高，間歇運動干預可顯著促進腎臟組織Trx-1表達（圖4）。

2.5 間歇運動顯著抑制心梗大鼠腎臟NOX2和NOX4的表達

Western blot結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟NOX2和NOX4表達顯著增加（P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠腎臟NOX2和NOX4表達顯著減少 （P<0.01） （圖5）。

2.6 間歇運動顯著增加心梗大鼠腎臟SOD1和SOD2的表達

Western blot結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎臟SOD1和SOD2表達顯著減少 （P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠腎臟SOD1和SOD2表達顯著增加 （P<0.01）（圖6）。

2.7 間歇運動顯著增加心梗大鼠腎臟T-AOC和GSH-PX水平，抑制腎臟MDA和LDH的表達

結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠腎組織勻漿中MDA含量和LDH活性顯著升高（P<0.01），T-AOC總抗氧化能力和GSH-PX活性顯著降低（P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠腎組織勻漿中MDA含量和LDH活性顯著降低（P<0.01），T-AOC總抗氧化能力和GSH-PX活性顯著升高（P<0.01） （表1）。

2.8 間歇運動顯著抑制心梗大鼠血清及尿液NAG的表達

ELISA結果顯示：與Sham組比較，MI組大鼠血清及尿液NAG表達顯著升高（P<0.01）;與MI組比較，ME組大鼠血清及尿液NAG表達顯著減少 （P<0.01）。這表明心梗受損導致腎功能紊亂，間歇運動干預可有效改善腎臟功能紊亂（圖7）。

2.9 腎臟miR-34a表達與SIRT1、Trx-1、氧化應激變化的相關性

相關性分析結果顯示，MI后血清 Trx-1與NAG表達呈顯著正相關（r=0.98，P<0.01）。腎臟SIRT1蛋白表達與NOX2、NOX4、MDA和LDH表達呈顯著負相關（r=-0.947，P<0.01;r=-0.931，P<0.01; r=-0.935，P<0.01;r=-0.856，P<0.01），與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著正相關（r =0.880，P<0.01; r=0.943，P<0.01; r =0.957，P<0.01; r=0.850，P<0.01）。表明，隨著腎臟SIRT1表達的增加，MI大鼠腎臟氧化應激減少。 MI及MI間歇運動后，腎臟miR-34a表達與SIRT1表達呈顯著負相關（r=-0.928，P<0.01），與MDA和LDH蛋白表達呈顯著正相關（r=0.964，P<001;r=0.972，P<0.05），與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著負相關（r=-0.969，P<0.01;r=-0.937，P<0.01;r=-0.942，P<0.01;r=-0.830，P<001）。 表明，大鼠腎臟miR-34a表達與腎臟氧化應激密切關系。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，除心臟損傷外，MI靶向遠隔器官損傷，包括大腦、肝臟和腎臟等[26]。先前的報道證實，MI后不久腎功能迅速下降[27]。心臟受損繼發(fā)腎損害進展的發(fā)病機制很復雜，就病理而言，氧化應激是MI的主要原因之一。由MI引起靶器官損害的嚴重程度與這個變量直接相關。新近研究證實，心肌缺血和缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）顯著增加血漿和腎臟MDA水平，下調腎臟SOD1、SOD2、GSH-Px和過氧化氫酶（catalase，CAT）基因表達，增加腎損傷標志物白細胞介素-18和腎損傷分子-1 （kidney injury molecule-1，KIM-1）的表達[28]。另研究證實，MI顯著增加循環(huán)和腎臟MDA水平，降低SOD和T-AOC活性，減弱腎臟抗氧化能力，導致腎臟形態(tài)結構和功能受損[29]。本研究與上述研究相一致，結果顯示，MI大鼠腎臟MDA含量和LDH活性顯著升高， SOD1和SOD2蛋白表達下降，T-AOC和GSH-PX活性顯著降低，腎損傷標志物NAG的血清和尿液水平顯著升高。結果提示，MI后腎臟氧化應激水平升高，抗氧化能力降低，腎臟功能受損。在正常和病理情況下，NOX是腎臟氧化應激的主要來源[5]，而NOX4主要在嚙齒動物的腎臟中表達[30]。體內外研究證實，AKI導致腎臟NOX4基因和蛋白表達增加，NOX4基因沉默可顯著減輕AKI導致的腎臟細胞凋亡和炎癥反應;利用NOX4基因沉默AKI小鼠進一步研究證實， NOX4沉默可恢復腎功能，減輕腎臟損害和減少炎癥反應[31]。結果表明，干預NOX4異常表達或將成為防治腎臟損傷的新靶點或策略。另研究證實，MI后腎臟NOX2和NOX4表達顯著增加，傳統(tǒng)中草藥復方心肌爾康顯著降低MI大鼠腎臟循環(huán)和腎臟MDA水平，提高SOD和T-AOC活性，減少腎臟NOX4表達，提升腎臟形態(tài)結構和功能[29];卡格列凈和恩格列凈可顯著降低糖尿病大鼠MI后腎臟NOX2和NOX4表達，降低腎損傷標志物中性粒細胞明膠酶相關的脂蛋白和KIM-1表達，保護腎功能[32-33]。除藥物外，有氧運動具有顯著抗氧化應激能力[34]。有氧運動可顯著抑制高鹽膳食大鼠股動脈和延髓腹側延髓中NADPH氧化酶亞基NOX4和NOX2的表達[35-36]，顯著減少冠心病患者主動脈NOX2和NOX4基因和蛋白表達[37]。另研究證實，有氧運動顯著降低卵巢切除大鼠腎臟脂質過氧化，上調腎臟CAT和SOD表達，改善腎臟氧化應激[38];顯著減少MI大鼠腎臟MDA水平，提升腎功能[7];顯著降低腎臟I/R大鼠腎臟MDA水平，升高GSH和CAT水平，減弱腎臟組織氧化應激[39]。本研究結果顯示，MI大鼠腎臟NOX2和NOX4蛋白表達顯著增加，間歇運動可顯著減少MI大鼠腎臟NOX2和NOX4蛋白表達，降低MDA含量和LDH活性，增加抗氧化劑SOD1和SOD2蛋白表達，提升T-AOC和GSH-PX活性，降低血清和尿液NAG水平。結果表明，心肌缺血誘發(fā)腎臟氧化應激，間歇運動可有效抑制MI后腎臟氧化應激，改善腎功能。

研究證實，miRs參與腎臟氧化應激的調節(jié)。缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導HK-2細胞中miR-423-5p表達增加，miR-423-5p過表達可顯著增加活性氧水平，上調MDA和GST活性，下調SOD活性，促進細胞氧化應激;miR-423-5p 基因沉默可顯著抑制H/R HK-2細胞氧化應激反應[40]。最新體內外研究發(fā)現(xiàn)， miR-27a-3p在腎臟I/R小鼠和H/R NRK-52E和HK-2細胞模型中表達上調，其過表達顯著降低腎臟I/R小鼠腎臟SOD水平，增加血尿素氮、血肌酐和MDA水平，加劇I/R引起的腎臟損害，而抑制其表達可顯著減輕腎臟I/R引起的氧化損傷[12]。另研究證實，miR-34a-5p上調表達在I/R大鼠心肌和I/R小鼠腸道中，加速活性氧積累，加劇心肌和腸氧化應激;抑制miR-34a-5p表達可抑制活性氧積累，減輕I/R導致的心肌和腸道損傷[41-42]。本研究結果顯示，MI大鼠腎臟miR-34a表達顯著增多，間歇運動顯著減少MI大鼠腎臟miR-34a表達，且腎臟miR-34a表達與MDA和LDH蛋白表達呈顯著正相關，與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著負相關。說明，間歇運動調節(jié)MI腎臟miR-34a表達，抑制腎臟氧化應激。業(yè)已證明，SIRT1在多種應激條件下的氧化損傷改善中起關鍵作用[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）大鼠腎功能不全，SIRT1和SOD活性降低，腎組織MDA升高。SIRT1上調表達可逆轉DN的生化、凋亡、氧化劑和病理學參數(shù)，上調SIRT1對DN具有保護作用，使腎臟細胞免受DN引起的進一步損害[45]。另研究證實，單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠腎臟氧化應激升高，SIRT1表達降低，而SIRT1激活可降低MDA水平，增加SOD、GPx和GSH水平，減弱腎臟氧化應激水平，表明SIRT1可能是纖維化腎病治療的有效靶點[46]。本研究結果顯示，MI大鼠腎臟SIRT1表達顯著降低;間歇運動顯著增加MI大鼠腎臟SIRT1表達，且腎臟SIRT1蛋白表達與MDA和LDH表達呈顯著負相關，與SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表達呈顯著正相關。提示，間歇運動調控MI大鼠腎臟SIRT1表達，調節(jié)腎臟氧化應激。研究證實，miR-34a靶向SIRT1參與氧化應激生理進程[47]。過氧化氫時間劑量依賴性上調支氣管上皮細胞microRNA-34a表達，下調SIRT1基因和蛋白表達，且miR-34a過表達顯著降低SIRT1的 mRNA和蛋白表達，miR-34a抑制劑增加了SIRT1 mRNA水平[48]。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導AKI大鼠和小鼠腎臟中miR-34a表達增加，SIRT1表達降低，MDA水平升高，SOD和GSH-PX表達降低;細胞實驗進一步研究證實，miR-34a過表達顯著降低順鉑誘導NRK-52E和HK-2細胞中SIRT1蛋白表達，增加氧化應激，提示miR-34a/SIRT1信號傳導是控制腎臟氧化應激的重要途徑[19]。本研究結果顯示，MI大鼠腎臟miR-34a表達顯著增多，SIRT1表達顯著降低，MDA和LDH水平升高，SOD1、SOD2和GSH-PX表達降低。間歇運動顯著減少MI大鼠腎臟miR-34a表達，增加SIRT1表達，降低MDA和LDH水平，升高SOD1、SOD2和GSH-PX水平，且腎臟miR-34a表達與SIRT蛋白表達呈顯著負相關。說明，間歇運動可能通過miR-34a/SIRT1信號通路調控MI腎臟氧化應激。

Trx-1是在幾乎所有真核細胞中表達豐富的125 kD胞質蛋白，在氧化還原信號中起重要作用。報道證實，循環(huán)Trx-1與全身氧化應激密切相關[49]，是可靠的氧化應激標志物。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢性心衰患者血清Trx-1表達顯著增加，腎小管損傷標志物NAG表達增加，且血漿Trx-1與腎損傷標志物NAG之間存在顯著相關性，提示血漿Trx-1水平與腎小管損傷和心臟預后相關，可能是鑒別高合并性心力衰竭和腎小管損傷風險的有用標志物[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI大鼠血清Trx-1水平顯著升高，血清及尿液NAG水平增多，且兩者存在顯著相關性，與上述研究結果相一致。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，MI大鼠腎臟Trx-1 mRNA表達同步增加，提示血清Trx-1可能是MI誘導腎臟損傷的生物標記物。實驗研究表明，Trx-1抑制心臟和腎臟組織的氧化應激[51-52]。過表達Trx-1可顯著減少MI小鼠心臟纖維化和氧化應激，減弱心肌細胞的凋亡，增加血管形成，改善心功能[51];Trx-1上調表達可顯著減少糖尿病小鼠腎臟氧化應激指標8-羥基-2′-脫氧鳥苷（8-OHdG）和丙烯醛加合物的表達，減緩腎小管損傷，表明Trx-1過表達會減輕腎臟氧化應激[52]。本研究結果顯示，間歇運動可顯著升高MI大鼠血清Trx-1水平，增加腎臟Trx-1 mRNA表達，降低腎臟氧化應激指標MDA和LDH的表達，提示，間歇運動上調Trx-1表達抑制MI腎臟氧化應激。另研究證實，心臟特異性過表達SIRT1可顯著上調I/R小鼠心肌Trx-1和SOD2表達，下調8-OHdG表達，調控I/R后的氧化應激水平[53]。動物和細胞實驗證實，SIRT1上調表達可顯著增加UUO小鼠腎臟和衣霉素誘導HK-2細胞中Trx的表達[54]，新型黃嘌呤氧化酶抑制劑非布索坦上調SIRT1-Trx表達，抑制UUO小鼠腎臟和衣霉素誘導腎小管細胞的內質網(wǎng)應激[55]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，Trx1可顯著降低ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞NADPH氧化酶活性，抑制NOX4和NOX2的表達，靶向降低NOX4-NOX2復合物水平，抑制細胞氧化應激[56]。表明，SIRT1-Trx介導的NOX4信號傳導是調節(jié)氧化應激的重要途徑。本研究結果顯示，間歇運動大鼠SIRT1表達增多，腎臟 Trx-1 mRNA表達增加，腎臟NOX2和NOX4表達降低，且SIRT1表達與NOX2和NOX4表達呈顯著負相關。提示，間歇運動可能激活心梗大鼠腎臟SIRT1-Trx-1介導的NOX4信號傳導通路。推測，間歇運動抑制MI大鼠腎臟氧化應激，保護腎臟功能，其機制與miR-34a-SIRT1-Trx-1介導的NOX4信號傳導通路激活密切相關。

4 結論

間歇運動可顯著抑制心梗大鼠腎臟miR-34a表達，增加SIRT1和Trx-1，降低NOX2、NOX4、MDA和LDH的表達，增加SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px的表達，抑制腎臟氧化應激。推測，MI 腎臟功能改善和腎臟miR-34a表達降低及下游SIRT1-Trx-1介導的NOX4信號通路激活關系密切。表明，間歇運動可能通過激活腎臟miR-34a/SIRT1/Trx-1信號通路，抑制腎臟氧化應激，改善MI 大鼠腎臟功能。

參考文獻：

[1]Van Dokkum R P， Eijkelkamp W B， Kluppel AC， et al. Myocardial infarction enhances progressive renal damage in an experimental model for cardio-renal interaction [J]. J Am Soc Nephrol， 2004， 15（12）

：3103-3110.

[2]Anzai A， Anzai T， Naito K， et al. Prognostic significance of acute kidney injury after reperfused ST-elevation myocardial infarction：synergistic acceleration of renal dysfunction and left ventricular remodeling [J]. J Card Fail， 2010， 16（5）：381-389.

[3]Granger DN， Kvietys PR. Reperfusion injury and reactive oxygen species：The evolution of a concept [J]. Redox Biol， 2015（6）：524-551.

[4]Gill PS， Wilcox CS. NADPH oxidases in the kidney [J]. Antioxid Redox Signal， 2006， 8（9/10）：1597-1607.

[5]Sedeek M， Nasrallah R， Touyz R M， et al. NADPH oxidases， reactive oxygen species， and the kidney：friend and foe [J]. J Am Soc Nephrol， 2013， 24（10）：1512-1518.

[6]Cho S， Yu SL， Kang J， et al. NADPH oxidase 4 mediates TGF-beta1/Smad signaling pathway induced acute kidney injury in hypoxia [J]. PLoS One， 2019， 14（7）：e0219483.

[7]Ranjbar K， Nazem F， Sabrinezhad R， et al. Aerobic training and L-arginine supplement attenuates myocardial infarction-induced kidney and liver injury in rats via reduced oxidative stress [J]. Indian Heart J， 2018， 70（4）：538-543.

[8]Ogawa Y， Takahashi J， Sakuyama A， et al. Exercise training delays renal disorders with decreasing oxidative stress and increasing production of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid in Dahl salt-sensitive rats [J]. J Hypertens， 2020， 38（7）：1336-1346.

[9]Tucker P S， Briskey D R， Scanlan A T， et al. High intensity interval training favourably affects antioxidant and inflammation mRNA expression in early-stage chronic kidney disease [J]. Free Radic Biol Med， 2015（89）：466-472.

[10]Tucker PS， Scanlan AT， Dalbo VJ. High Intensity Interval Training Favourably Affects Angiotensinogen mRNA Expression and Markers of Cardiorenal Health in a Rat Model of Early-Stage Chronic Kidney Disease [J]. Biomed Res Int， 2015（2015）：156584.

[11]Martello G， Rosato A， Ferrari F， et al. A MicroRNA targeting dicer for metastasis control [J]. Cell， 2010， 141（7）：1195-1207.

[12]Zhao XR， Zhang Z， Gao M， et al. MicroRNA-27a-3p aggravates renal ischemia/reperfusion injury by promoting oxidative stress via targeting growth factor receptor-bound protein 2 [J]. Pharmacol Res， 2020（155）：104718.

[13]Guclu A， Kocak C， Kocak F E， et al. Micro RNA-320 as a novel potential biomarker in renal ischemia reperfusion [J]. Ren Fail， 2016， 38（9）：1468-1475.

[14]Zhang H， Zhao Z， Pang X， et al. MiR-34a/sirtuin-1/foxo3a is involved in genistein protecting against ox-LDL-induced oxidative damage in HUVECs [J]. Toxicol Lett， 2017（277）：115-122.

[15]Zhao N， Wang G， Long S， et al. MicroRNA-34a deficiency leads to impaired wound closure by augmented inflammation in mice [J]. Ann Transl Med， 2020， 8（7）：447.

[16]Barangi S， Mehri S， Moosavi Z， et al. Melatonin inhibits Benzo（a）pyrene-Induced apoptosis through activation of the Mir-34a/Sirt1/autophagy pathway in mouse liver [J]. Ecotoxicol Environ Saf， 2020（196）：110556.

[17]Yamakuchi M， Ferlito M， Lowenstein C J. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2008， 105（36）：13421-13426.

[18]Kitada M， Kume S， Koya D. Role of sirtuins in kidney disease [J]. Curr Opin Nephrol Hypertens， 2014， 23（1）：75-79.

[19]Zhang Y， Tao X， Yin L， et al. Protective effects of dioscin against cisplatin-induced nephrotoxicity via the microRNA-34a/sirtuin 1 signalling pathway [J]. Br J Pharmacol， 2017， 174（15）：2512-2527.

[20]Bilginoglu A. Cardiovascular protective effect of pioglitazone on oxidative stress in rats with metabolic syndrome [J]. J Chin Med Assoc， 2019，82（6）：452-456.

[21]Nishida K， Watanabe H， Ogaki S， et al. Renoprotective effect of long acting thioredoxin by modulating oxidative stress and macrophage migration inhibitory factor against rhabdomyolysis-associated acute kidney injury [J]. Sci Rep， 2015（5）：14471.

[22]Kim H， Baek CH， Lee RB， et al. Anti-Fibrotic Effect of Losartan， an Angiotensin II Receptor Blocker， Is Mediated through Inhibition of ER Stress via Up-Regulation of SIRT1， Followed by Induction of HO-1 and Thioredoxin [J]. Int J Mol Sci， 2017， 18（2）：305.

[23]Oghbaei H， Ahmadi Asl N， Sheikhzadeh F. Can regular moderate exercise lead to changes in miRNA-146a and its adapter proteins in the kidney of streptozotocin-induced diabetic male rats？[J]. Endocr Regul， 2017， 51（3）：145-152.

[24]Silva F C D， Iop R D R， Andrade A， et al. Effects of Physical Exercise on the Expression of MicroRNAs：A Systematic Review [J]. J Strength Cond Res， 2020， 34（1）：270-280.

[25]Wisloff U， Loennechen J P， Currie S， et al. Aerobic exercise reduces cardiomyocyte hypertrophy and increases contractility， Ca2+ sensitivity and SERCA-2 in rat after myocardial infarction [J]. Cardiovasc Res， 2002， 54（1）：162-174.

[26]Morooka S， Hayashi T， Takayanagi K， et al. Effects of secondary organ failure on compensation of acute heart failure in patients with myocardial infarct and dilated cardiomyopathy [J]. Jpn Circ J， 1992， 56（5）：518-523.

[27]Mashima Y， Konta T， Ichikawa K， et al. Rapid decline in renal function after acute myocardial infarction [J]. Clin Nephrol， 2013， 79（1）：15-20.

[28]Sirijariyawat K， Ontawong A， Palee S， et al. Impaired renal organic anion transport 1 （SLC22A6） and its regulation following acute myocardial infarction and reperfusion injury in rats [J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis， 2019， 1865（9）：2342-2355.

[29]Lian F Z， Cheng P， Ruan C S， et al. Xin-Ji-Er-Kang ameliorates kidney injury following myocardial infarction by inhibiting oxidative stress via Nrf2/HO-1 pathway in rats [J]. Biomed Pharmacother， 2019（117）：109124.

[30]Li Z， Sheng Y， Liu C， et al. Nox4 has a crucial role in uric acidinduced oxidative stress and apoptosis in renal tubular cells [J]. Mol Med Rep， 2016， 13（5）：4343-4348.

[31]Meng X M， Ren G L， Gao L， et al. NADPH oxidase 4 promotes cisplatin-induced acute kidney injury via ROS-mediated programmed cell death and inflammation [J]. Lab Invest， 2018， 98（1）：63-78.

[32]Kimura Y， Kuno A， Tanno M， et al. Canagliflozin， a sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor， normalizes renal susceptibility to type 1 cardiorenal syndrome through reduction of renal oxidative stress in diabetic rats [J]. J Diabetes Investig， 2019， 10（4）：933-946.

[33]Kuno A， Kimura Y， Mizuno M， et al. Empagliflozin attenuates acute kidney injury after myocardial infarction in diabetic rats [J]. Sci Rep， 2020， 10（1）：7238.

[34]Pingitore A， Lima GP， Mastorci F， et al. Exercise and oxidative stress：potential effects of antioxidant dietary strategies in sports [J]. Nutrition， 2015， 31（7/8）：916-922.

[35]Guers J J， Kasecky-Lardner L， Farquhar W B， et al. Voluntary wheel running prevents salt- induced endothelial dysfunction：role of oxidative stress [J]. J Appl Physiol， 2019， 126（2）：502-510.

[36]Li H B， Huo C J， Su Q， et al. Exercise Training Attenuates Proinflammatory Cytokines， Oxidative Stress and Modulates Neurotransmitters in the Rostral Ventrolateral Medulla of Salt-Induced Hypertensive Rats [J]. Cell Physiol Biochem， 2018， 48（3）：1369-1381.

[37]Adams V， Linke A， Krankel N， et al. Impact of regular physical activity on the NAD（P）H oxidase and angiotensin receptor system in patients with coronary artery disease [J]. Circulation， 2005， 111（5）：555-562.

[38]da Silva Dias D， Moraes-Silva I C， Bernardes N， et al. Exercise training initiated at old stage of lifespan attenuates aging-and ovariectomy-induced cardiac and renal oxidative stress：Role of baroreflex [J]. Exp Gerontol， 2019（124）：110635.

[39]Elsaid F H， Khalil A A， Ibrahim E M， et al. Effects of exercise and stevia on renal ischemia/ reperfusion injury in rats [J]. Acta Sci Pol Technol Aliment， 2019， 18（3）：317-332.

[40]Yuan X P， Liu L S， Chen C B， et al. MicroRNA-423-5p facilitates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in renal proximal tubular epithelial cells by targeting GSTM1 via endoplasmic reticulum stress [J]. Oncotarget， 2017， 8（47）：82064-82077.

[41]Wang Z， Wang T， Yuan J， et al. Inhibition of miR-34a-5p protected myocardial ischemia reperfusion injury-induced apoptosis and reactive oxygen species accumulation through regulation of Notch Receptor 1 signaling [J]. Rev Cardiovasc Med， 2019， 20（3）：187-197.

[42]Wang G， Yao J， Li Z， et al. miR-34a-5p Inhibition Alleviates Intestinal Ischemia/Reperfusion-Induced Reactive Oxygen Species Accumulation and Apoptosis via Activation of SIRT1 Signaling [J]. Antioxid Redox Signal， 2016， 24（17）：961-973.

[43]Salminen A， Kaarniranta K， Kauppinen A. Crosstalk between Oxidative Stress and SIRT1：Impact on the Aging Process [J]. Int J Mol Sci， 2013， 14（2）：3834-3859.

[44]Zhang W， Huang Q， Zeng Z， et al. Sirt1 Inhibits Oxidative Stress in Vascular Endothelial Cells [J]. Oxid Med Cell Longev， 2017（2017）：7543973.

[45]Ahmed H H， Taha F M， Omar H S， et al. Hydrogen sulfide modulates SIRT1 and suppresses oxidative stress in diabetic nephropathy [J]. Mol Cell Biochem， 2019， 457（1/2）：1-9.

[46]Ren Y， Du C， Shi Y， et al. The Sirt1 activator， SRT1720， attenuates renal fibrosis by inhibiting CTGF and oxidative stress [J]. Int J Mol Med， 2017， 39（5）：1317-1324.

[47]Xiong H， Chen S， Lai L， et al. Modulation of miR-34a/SIRT1 signaling protects cochlear hair cells against oxidative stress and delays age-related hearing loss through coordinated regulation of mitophagy and mitochondrial biogenesis [J]. Neurobiol Aging， 2019（79）：30-42.

[48]Baker JR， Vuppusetty C， Colley T， et al. Oxidative stress dependent microRNA-34a activation via PI3Kalpha reduces the expression of sirtuin-1 and sirtuin-6 in epithelial cells [J]. Sci Rep， 2016（6）：35871.

[49]Jekell A， Hossain A， Alehagen U， et al. Elevated circulating levels of thioredoxin and stress in chronic heart failure [J]. Eur J Heart Fail， 2004， 6（7）：883-890.

[50]Otaki Y， Watanabe T， Takahashi H， et al. Association of plasma thioredoxin-1 with renal tubular damage and cardiac prognosis in patients with chronic heart failure [J]. J Cardiol， 2014， 64（5）：353-359.

[51]Adluri RS， Thirunavukkarasu M， Zhan L， et al. Thioredoxin 1 enhances neovascularization and reduces ventricular remodeling during chronic myocardial infarction：a study using thioredoxin 1 transgenic mice [J]. J Mol Cell Cardiol， 2011， 50（1）：239-247.

[52]Hamada Y， Miyata S， Nii-Kono T， et al. Overexpression of thioredoxin1 in transgenic mice suppresses development of diabetic nephropathy [J]. Nephrol Dial Transplant， 2007， 22（6）：1547-1557.

[53]Hsu CP， Zhai P， Yamamoto T， et al. Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/ reperfusion [J]. Circulation， 2010， 122（21）：2170-2182.

[54]Chang J W， Kim H， Baek C H， et al. Up-Regulation of SIRT1 Reduces Endoplasmic Reticulum Stress and Renal Fibrosis [J]. Nephron， 2016， 133（2）：116-128.

[55]Kim H， Baek C H， Chang J W， et al. Febuxostat， a novel inhibitor of xanthine oxidase， reduces ER stress through upregulation of SIRT1-AMPK-HO-1/thioredoxin expression [J]. Clin Exp Nephrol， 2020， 24（3）：205-215.

[56]Chen B， Meng L， Shen T， et al. Thioredoxin attenuates oxidized low-density lipoprotein induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells by reducing NADPH oxidase activity [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2017， 490（4）：1326-1333.