張敏 彭朋 秦永生 何瑞波 馬剛

摘 要：目的：以自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）為模型，觀察不同負荷劑量高強度間歇訓(xùn)練（HIIT）對腎臟損傷的影響并探討細胞外基質(zhì)（ECM）代謝與腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）在其間的可能作用機制，為高血壓腎病患者完善健康管理以及優(yōu)化運動康復(fù)方案提供依據(jù)。方法：45只雄性SHR按照隨機數(shù)字表分為安靜組（SHR-Sed）、低負荷劑量HIIT組（SHR-loHIIT）和高負荷劑量HIIT組（SHR-hiHIIT），同時將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對照組（WKY）。WKY和SHR-Sed組在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng);SHR-loHIIT和SHR-hiHIIT組分別進行18周不同負荷量HIIT，兩組運動強度保持一致，但SHR-loHIIT組總負荷劑量僅為SHR-hiHIIT組的1/4。實驗后，利用無創(chuàng)血壓儀檢測尾動脈血壓;測定24 h尿蛋白、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）含量評價腎功能;過碘酸-希夫（PAS）和馬森（Masson）染色進行腎臟病理組織學(xué)觀察并獲取腎小球和腎小管損傷評分以及纖維化指數(shù);透射電子顯微鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu);免疫印跡測定ECM合成因子—轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）以及ECM降解因子—基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和組織金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表達量;免疫組織化學(xué)染色檢測腎小管EMT標(biāo)志物—α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-CA）的分布與表達量。結(jié)果：1）腎臟損傷與纖維化：與WKY組比較，SHR-Sed組血壓升高，腎小球萎縮、基底膜增厚、間質(zhì)膠原纖維大量沉積，足細胞數(shù)量減少、足突融合破壞，腎小球和腎小管損傷評分以及纖維化指數(shù)升高，腎功能下降（P<0.05）;與SHR-Sed組比較，SHR-loHIIT組血壓降低，腎小球和腎小管病變減輕，纖維化指數(shù)以及組織損傷評分下降，腎功能改善（P<0.05），而SHR-hiHIIT組血壓水平、病理組織學(xué)變化、組織損傷評分以及纖維化指數(shù)進一步升高（P<0.05），但腎功能無顯著性變化（P>0.05）。2）ECM代謝通路：與WKY組比較，SHR-Sed組TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF蛋白表達上調(diào)（P<0.05），MMP-9/TIMP-1比值下降（P<0.05）;與SHR-Sed組比較，SHR-loHIIT組TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表達下調(diào)（P<0.05），MMP-9/TIMP-1比值升高（P<0.05），而SHR-hiHIIT組MMP-9/TIMP-1比值下降（P<0.05），TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表達水平無顯著性變化（P>0.05）。3）腎小管EMT：與WKY組比較，SHR-Sed組腎小管上皮中E-CA表達下降、腎小管上皮和間質(zhì)α-SMA升高（P<0.05）;與SHR-Sed組比較，SHR-loHIIT組E-CA表達升高、α-SMA下降（P<0.05），而SHR-hiHIIT組E-CA和α-SMA分布與表達量無顯著性變化（P>0.05）。結(jié)論：長期HIIT對高血壓腎病大鼠的健康效應(yīng)與負荷劑量有關(guān)，低負荷劑量HIIT通過促進ECM降解、降低ECM合成并抑制腎小管EMT減輕腎臟纖維化，而高負荷劑量HIIT則通過抑制ECM降解（但對ECM合成無影響）加重腎臟纖維化;此外，高負荷劑量HIIT并未進一步促進EMT，因此高強度運動誘導(dǎo)的腎臟纖維化可能具有可逆性特征。研究提示，心血管疾病患者以HIIT作為主要方式進行運動康復(fù)時應(yīng)持謹慎態(tài)度并采用低負荷劑量，其臨床決策（可行性、安全性和有效性）仍需更多循證證據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：高血壓腎病;腎臟損傷;高強度間歇訓(xùn)練;負荷劑量;細胞外基質(zhì);上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

中圖分類號：G804.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-2076（2020）06-0054-11

Abstract：Objective： Spontaneous hypertensive rats （SHR） were used as animal models to explore the effect of different load doses of high-intensity interval training （HIIT） on renal fibrosis and investigate the possible mechanism of extracellular matrix （ECM） metabolism and renal tubular epithelial-mesenchymal transition （EMT）， so as to provide the optimal exercise protocol for the health management of patients with hypertensive nephropathy. Methods： 45 male SHR were divided into sedentary （SHR-sed）， low load-dose （SHR-loHIIT） or high load-dose （SHR-hiHIIT） groups according to a random number table， at the same time， ten Wistar Kyoto rats were used as normal blood pressure control group （WKY）. Animals in WKY and SHR-Sed groups were bred quietly in cages， and those of SHR-loHIIT and SHR-hiHIIT groups performed 18-week different load dose of HIIT. Training intensity maintained consistent but the total load dose of SHR-loHIIT group was only 1/4 of SHR-hiHIIT group. After the experiment， parameters were measured including blood pressure of the tail artery by non-invasive blood pressure monitor; renal function by 24 h urine protein （UP）， blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （SCr） content; histopathological observation by periodic acid-Schiff （PAS） and Masson staining to obtain glomerular and tubular injury score and fibrosis index; ultrastructure of kidney tissue by transmission electron microscope; protein expression levels of ECM synthesis factors such as transforming growth factor β1 （TGF-β1）， phosphorylated Smad2/3 （p-Smad2/3） and connective tissue growth factor （CTGF）， and ECM degradation factors such as matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and tissue metalloproteinase inhibitor-1 （TIMP-1） by Western blot; distribution and expression of smooth muscle actin （α-SMA） and E-cadherin （E-CA） by immunohistochemical staining. Results： 1） Renal injury and fibrosis：Compared with WKY group， SHR-Sed group has increased blood pressure， glomerular atrophy， thickening of the basement membrane， large deposition of interstitial collagen fibers， reduced number of podocytes， foot processes fusion and destruction， glomerular and tubular damage scores as well as fibrosis index increased， renal function decreased （P<0.05）; compared with SHR-Sed group， blood pressure decreased， lesions in the glomerulus and tubules alleviated， fibrosis index and the tissue injury score decreased， and renal function improved （P<0.05） in the SHR-loHIIT group， while the blood pressure level， histopathological change， tissue injury score glomerular and fibrosis index further increased （P<0.05）， however， there was no significant change in renal function （P>0.05） in the SHR-hiHIIT group. 2） ECM metabolism pathway：Compared with WKY group， protein expressions of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF up-regulated （P<0.05）， and the ratio of MMP-9/TIMP-1 decreased （P<0.05） in SHR-Sed group; compared with SHR-Sed group， protein expressions of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF up-regulated （P<0.05）， and the ratio of MMP-9/TIMP-1 increased （P<0.05） in SHR-loHIIT group; the ratio of MMP-9/TIMP-1 decreased （P<0.05）， and there was no significant change in the protein expression levels of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF （P>0.05） in SHR-hiHIIT group. 3） Renal tubular EMT：Compared with WKY group， E-CA expression decreased in renal tubular epithelium and α-SMA increased in tubular epithelium and interstitium （P<0.05） in SHR-Sed group; compared with SHR-Sed group， E-CA expression increased and α-SMA decreased （P<0.05） in SHR-loHIIT group， while distribution and expression of E-CA and α-SMA had no significant changes （P>0.05） in SHR-hiHIIT group. Conclusion：Health effect of long-term HIIT on hypertensive nephropathy are load-doses dependent. Low load-dose HIIT reduces renal fibrosis by promoting ECM degradation， reducing ECM synthesis and inhibiting renal tubular EMT， while high load-dose HIIT aggravates renal fibrosis via inhibiting ECM degradation （but has no effect on ECM synthesis）; in addition， high load-dose HIIT do not further promote EMT， thus high intensity training-induced renal fibrosis may have reversible characteristics. This study suggests that patients with cardiovascular disease should be cautious to adopt HIIT as main modality in exercise rehabilitation and use low load dose， and the clinical decision （feasibility， security and availability） still needs to be further confirmed by evidence-based medicine.

Key words： hypertensive nephropathy; renal injury; high-intensity interval training; load doses; extracellular matrix; epithelial-mesenchymal transition

高血壓是全世界最常見的心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD），可并發(fā)心臟、血管、腦、腎臟、視網(wǎng)膜等終末器官損害，嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[1]。腎臟是高血壓最常累及的靶器官之一，持續(xù)血壓升高通過神經(jīng)體液途徑造成腎臟損傷并逐漸出現(xiàn)腎臟纖維化，最終發(fā)展為腎功能衰竭（腎衰）和尿毒癥，稱為高血壓腎病[2]。腎臟纖維化是各種原因?qū)е履I衰的必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常積聚、腎單位數(shù)量減少以及腎小球濾過率下降，從而造成腎臟不可逆的損傷[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/Smad信號通路[3]和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）/組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）穩(wěn)態(tài)平衡[4]分別介導(dǎo)ECM合成與降解，此外TGF-β1/Smad還可通過調(diào)節(jié)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）誘導(dǎo)上皮細胞向具有更強ECM分泌能力的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化而參與腎臟纖維化的形成與進展[3]。調(diào)控TGF-β1/Smad信號活性和MMP-9/TIMP-1平衡能夠減輕腎臟ECM沉積和EMT進程[3]，因此是防治腎臟纖維化的重要生物學(xué)靶點。

研究指出，體力活動水平與腎病患者生存率顯著正相關(guān)[5]，且運動對患者具有多維度健康效益[6]，包括降低心血管危險因素、改善身體機能，提高運動能力和生活質(zhì)量。中低強度持續(xù)有氧運動（簡稱有氧運動，下同）如跑步、游泳、騎車等是腎病患者運動康復(fù)的主要方式[6， 7]，然而由于持續(xù)時間較長、枯燥乏味，患者往往難以長期堅持[8]。如何花費更少的時間達到同樣或更佳的鍛煉效果成為眾多人追求的目標(biāo)。作為近年來新興的運動模式——高強度間歇訓(xùn)練（high-intensity interval training，HIIT），已被廣泛證實能夠明顯改善健康受試對象（普通人、運動員、實驗動物）的生理機能及運動能力，具有時效性、趣味性、易于接受等突出優(yōu)勢[9]。然而HIIT對CVD（尤其是實驗動物）的作用報道不一[10-14]，其是否適用于腎病患者鮮有關(guān)注。課題組前期的研究證實，18周中等強度間歇運動改善了自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）病理性心臟肥大[11]，而高負荷劑量HIIT（20～56 min/d，3～5 d/w）后則發(fā)生心功能惡化[12]，表明長期間歇訓(xùn)練對高血壓的影響與運動強度有關(guān)，這在Holloway等[10， 13]的研究中同樣得到證實，HIIT的作用遭到質(zhì)疑。值得注意的是，4～20 min/d、2～3 d/w的低負荷劑量HIIT能夠改善CVD患者心臟重塑[15-16]，提示HIIT的作用可能與負荷劑量有關(guān)。為驗證這一推斷，本研究以SHR為模型，觀察不同負荷劑量HIIT對腎臟損傷和腎臟纖維化的影響并探討ECM代謝和腎小管EMT在其間的可能作用機制，以期為高血壓腎病患者完善健康管理以及優(yōu)化運動康復(fù)處方提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與分組

10只Wistar-Kyoto大鼠以及45只3月齡雄性SHR，體重（216±14）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0027。將SHR按照隨機數(shù)字表隨機分為安靜組（SHR sedentary，SHR-Sed）、高負荷劑量HIIT組（SHR high load-dose HIIT，SHR-hiHIIT）和低負荷劑量HIIT組（SHR low load-dose HIIT，SHR-loHIIT），每組n=15。將Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對照組（WKY）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（24～26）℃，濕度50%～60%，12：12 h明暗周期，分籠（5只/籠）標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由進食水。WKY和SHR-Sed組動物在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)，SHR-hiHIIT和SHR-loHIIT組分別進行18周不同負荷劑量的HIIT。

1.2 運動方案

所有動物先進行5 d適應(yīng)性跑臺（段氏DSPT-208型，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）訓(xùn)練（強度：10～15 m/min，坡度：0°，時間：10～15 min/d）。隨后按照課題組既往建立的遞增負荷運動實驗測定峰值跑速（maximal velocity，Vmax）[11-12]：起始負荷5 m/min，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭（坡度始終為0°），記錄最后一級負荷對應(yīng)的跑速即為Vmax。隨后SHR-hiHIIT和SHR-loHIIT組分別進行18周不同負荷劑量HIIT，分別于第4、8、12和16周重新測定Vmax并及時調(diào)整運動強度[12]。兩組運動強度相同，從第3周開始，SHR-hiHIIT組每次運動時間、重復(fù)次數(shù)以及運動頻率逐漸高于SHR-loHIIT組，具體訓(xùn)練方案詳見表1。

1.3 尾動脈血壓測定

每周訓(xùn)練前以及末次訓(xùn)練后48 h，大鼠處于清醒、安靜狀態(tài)下，采用智能無創(chuàng)血壓測量儀（BP-2010E，日本Softron公司）測定尾動脈血壓，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），連續(xù)監(jiān)測三次，取均值。

1.4 尿液、血液標(biāo)本采集以及組織取材

末次尾動脈血壓測定后將大鼠置于單獨的代謝籠（Columbus CLAMS，美國Columbus公司）中24 h，給予禁食（不限制飲水），用50 mL離心管持續(xù)收集尿液，4℃、3000 rpm離心10 min取上清。大鼠稱量體重后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（劑量：0.1 mg/kg）麻醉并仰臥固定，腹主動脈取血5 mL，4℃、3000 rpm離心20 min取血清。分離心臟、腎臟和腎上腺以及胸腺，迅速在冷生理鹽水中洗滌，濾紙吸干水分后分別稱重（mg）并計算與體重（g）的比值作為心臟質(zhì)量指數(shù)、腎臟質(zhì)量指數(shù)、腎上腺質(zhì)量指數(shù)和胸腺質(zhì)量指數(shù)。將左側(cè)腎臟分為兩部分，一部分用經(jīng)4%甲醛溶液固定12 h后經(jīng)脫水、包埋、制作4 μm組織切片并用光鏡進行病理組織學(xué)觀察，另一部分用戊二醛和鋨酸固定并進行組織超微結(jié)構(gòu)觀察（醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色）;右側(cè)腎臟投入液氮中進行蛋白印跡分析。

1.5 腎功能以及血清皮質(zhì)酮含量檢測

采用光柵分光光度計（722 型，上海分析儀器廠）以雙縮脲法檢測尿液樣本24 h尿蛋白含量（urine protein，UP）（單位：mg/24 h），全自動生化分析儀（AU680，美國Bachman公司）以酶法檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（單位：mmol/L）及血清肌酐（serum creatinine，SCr）（單位：μmol/L）含量。利用全自動酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，美國Thermo公司）以酶聯(lián)免疫吸附法測定血清皮質(zhì)酮（單位：pg/mL）。嚴格按照試劑盒（均購自武漢博士德生物工程有限公司）說明進行操作，每個指標(biāo)重復(fù)三次，取均值。

1.6 腎臟病理組織學(xué)觀察

組織切片脫臘后分別進行過碘酸-希夫（periodic acid–Schiff，PAS）染色和馬森（Masson）染色，中性樹膠封片。每只大鼠取3張切片，每張切片隨機選取10個高倍視野（×400），光學(xué)顯微鏡（IX71型，日本奧林巴斯公司）下觀察腎臟組織病理形態(tài)改變情況。PAS染色觀察腎小球和腎小管病理變化，Masson染色觀察腎臟間質(zhì)膠原纖維的變化。采用半定量評分系統(tǒng)分析腎小球或腎小管損傷，按損傷程度由輕到重評分為0～3分：0分，正常腎臟;1分（輕度損傷），病變范圍<25%;2分（中度損傷），病變范圍占25%～50%;3分（重度損傷），病變范圍>50%[17-18]。用Masson染色切片鏡下藍色面積與所觀察視野面積的比值代表纖維化指數(shù)。

1.7 透射電子顯微鏡觀察

組織樣品經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次（每次5 min），梯度濃度乙醇脫水15 min。環(huán)氧丙烷滲透組織，室溫下環(huán)氧樹脂和丙酮包埋24 h，制作50～60 nm切片，3%醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡（JEM-2100 Plus，日本松永電子公司）觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)。

1.8 免疫印跡分析

腎臟組織勻漿后于4°C、12 000 g離心5 min，取上清，考馬斯亮藍測定總蛋白質(zhì)濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下將PVDF膜在5%脫脂牛奶中孵育3 h。將PVDF膜與TGF-β1（稀釋比1∶2000，Santa cruz公司）、Smad2（稀釋比1∶1000，Abcam公司）、Smad3（稀釋比1∶1000，Abcam公司）、磷酸化Smad2（p-Smad2）（稀釋比1∶1000，Abcam公司）、磷酸化Smad3（p-Smad3）（稀釋比1∶1000，Abcam公司）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）（稀釋比1∶2000，Santa cruz公司）、MMP-9（稀釋比1∶2000，Santa cruz公司）和TIMP-1（稀釋比1∶2000，Abcam公司）一抗4℃過夜。TBST洗滌4次（每次10 min），加入鼠抗兔二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG）（稀釋比1∶5000，武漢博士德生物工程有限公司），室溫孵育3 h。使用ECL發(fā)光成像，掃描各條帶灰度值，使用ImagePro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量。內(nèi)參蛋白為β-actin（稀釋比1∶10 000，Abcam公司），將目的蛋白灰度值與β-actin的比值作為相對表達量，計算各組蛋白相對表達量與WKY組的比值作為相對表達率。

1.9 免疫組織化學(xué)染色

腎組織切片脫蠟，抗原修復(fù)30 min。室溫下用甲醇和過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，將載玻片于37°C下用0.5%牛血清白蛋白封閉60 min，加入α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-CA）一抗（稀釋比1：200，Abcam公司）4°C過夜。用PBS洗滌后，將樣品與鼠抗兔二抗（稀釋比1：500，武漢博士德生物工程有限公司）37°C孵育1 h，PBS洗滌3次（每次5 min）。滴加DAB顯影液，室溫下用蘇木精復(fù)染細胞核5 min，乙醇梯度脫水，二甲苯洗滌，中性樹膠密封固定。使用光學(xué)顯微鏡（IX71型，日本OLYMPUS公司）選取10個高倍視野（×400）拍照，Image-Pro Plus 6.0分析軟件計算平均光密度（optical density，OD）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理與分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析和處理。所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 8.5作圖。生存分析以Kaplan-Meier曲線表示， 生存率的組間比較采用 Log-rank檢驗;血壓的時程變化使用重復(fù)測量的方差分析;其他各參數(shù)的組間比較使用單因素方差分析，多重比較使用Tukey檢驗。顯著性水平定為α=0.05。

3 討論

3.1 不同負荷劑量HIIT對高血壓腎病大鼠腎臟損傷以及纖維化的影響

在本研究中，低負荷劑量HIIT能夠降低SHR血壓水平，同時減輕高血壓誘導(dǎo)的腎臟損傷與纖維化并提高腎功能，因此對高血壓腎病具有改善作用。這與針對中等強度游泳、跑臺等方式的研究結(jié)果一致[19-20]，提示低負荷劑量HIIT與傳統(tǒng)有氧運動的作用效果相似。更為重要的是，SHR-loHIIT組采用的負荷劑量（58 min/w）明顯低于美國運動醫(yī)學(xué)會（American College of Sports Medicine，ACSM）推薦CVD患者發(fā)展或維持心血管健康和體適能的最低推薦量（150 min/w中等強度或75 min/w高強度運動[21]），因此具有明顯的時效性。研究指出[22]，運動的健康效應(yīng)在一定程度上與運動劑量正相關(guān)，故推測增加運動量可能會進一步改善腎臟損傷。然而出乎意料的是，高劑量HIIT后血壓水平不降反升，腎臟損傷與纖維化進一步加重，但腎臟功能并未受明顯影響，可能與腎臟具有強大的代償能力有關(guān)，同時生存率和死亡率與其他各組并無統(tǒng)計學(xué)差異。Aparicio等[23]的研究同樣證實，Wistar大鼠進行4 d/w共12周的高強度抗阻間歇訓(xùn)練后腎臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，間質(zhì)結(jié)締組織面積增加，但腎功能無明顯變化。上述結(jié)果提示，維持相同運動強度，HIIT對高血壓腎病的作用效果呈現(xiàn)運動負荷劑量依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉嚴重損傷時釋放肌紅蛋白（運動性橫紋肌溶解癥）損傷腎小管以及腎臟缺血-再灌注（運動期缺血、恢復(fù)期再灌注）是高強度劇烈運動誘導(dǎo)腎損害的重要原因[24]。

3.2 不同負荷劑量HIIT對高血壓腎病大鼠ECM代謝和腎小管EMT影響

ECM合成與降解失衡是腎臟纖維化的直接原因，這一過程主要受TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]和MMP-9/TIMP-1穩(wěn)態(tài)平衡[4]的調(diào)控。在本研究中，SHR-Sed組TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表達上調(diào)，提示TGF-β1/Smad途徑激活并上調(diào)下游靶基因CTGF表達，后者以自/旁分泌方式作用于腎臟局部，促進ECM合成[3];MMP-9表達下調(diào)而TIMP-1上調(diào)，MMP-9/TIMP-1比值下降，說明TIMP-1對MMP-9的抑制效應(yīng)增強，ECM降解速率下降。因此，SHR腎臟纖維化的形成是ECM合成增加和降解減少共同作用的結(jié)果。低負荷劑量HIIT后TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表達降低，說明ECM合成減少;MMP-9上調(diào)而TIMP-1下降，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明TIMP-1對MMP-9的抑制作用得以解除，ECM降解增多。由于TIMP-1同樣是TGF-β1下游靶基因[25]，TGF-β1上調(diào)TIMP-1表達而間接抑制MMP-9活性，故低負荷劑量HIIT還可通過抑制TGF-β1/Smad途徑加速ECM降解。總之，低負荷劑量HIIT同時促進ECM降解并抑制其合成而改善SHR腎臟纖維化，TGF-β1/Smad信號途徑和MMP-9/TIMP-1穩(wěn)態(tài)平衡則是規(guī)律運動發(fā)揮腎臟保護效應(yīng)的關(guān)鍵靶點。然而高負荷劑量HIIT后，TGF-β1/p-Smad信號活性較SHR-Sed組并無顯著性改變，提示ECM合成未受影響。但在一項長期高強度耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)健康大鼠心臟纖維化的研究中，心肌TGF-β1明顯上調(diào)[26]，研究結(jié)果存在差異可能與實驗動物的健康狀態(tài)、訓(xùn)練方案以及組織特異性有關(guān)。有趣的是，SHR-hiHIIT組TIMP-1表達下調(diào)，似乎暗示TIMP-1抑制ECM降解的作用減弱，然而MMP-9表達量和MMP-9/TIMP-1比值同時下降則說明TIMP-1對MMP-9活性的抑制作用進一步增強，ECM降解減少。此外，TIMP-1下降而TGF-β1無顯著性變化，提示尚存在其他調(diào)控TIMP-1的信號途徑。總之，長期高負荷劑量HIIT通過抑制ECM降解而加重腎臟纖維化，但對ECM合成并無明顯影響。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[27]，腎小管EMT是導(dǎo)致腎纖維化的核心機制，因腎纖維化時超過1/3的間質(zhì)肌成纖維細胞來源于局部腎小管上皮發(fā)生的EMT。EMT是上皮細胞向位于細胞基質(zhì)的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，腎臟EMT主要發(fā)生在腎小管，上皮細胞在丟失細胞間緊密連接并失去極性的同時，其表型亦發(fā)生顯著改變，如上皮細胞標(biāo)志物E-CA逐漸喪失，轉(zhuǎn)而表達更多的間質(zhì)細胞表型α-SMA[27]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，EMT主要受TGF-β1/Smad信號途徑的調(diào)控。本研究同樣證實SHR發(fā)生EMT，即SHR-Sed組TGF-β1/Smad信號激活的同時腎小管上皮細胞E-CA表達減少，而間質(zhì)中α-SMA明顯上調(diào)。低負荷劑量HIIT則通過下調(diào)間質(zhì)α-SMA以及上調(diào)腎小管上皮E-CA表達而抑制腎臟EMT進程，這在中等強度有氧運動（跑臺[28]、游泳[19]）的研究中亦得到佐證，其機制可能與運動下調(diào)TGF-β1/Smad[19]以及非Smad依賴性信號途徑[28]活性有關(guān)。出乎意料的是，SHR-hiHIIT組E-CA和α-SMA的分布和表達量與SHR-Sed組并無差異，這與該組TGF-β1/Smad信號活性無顯著性變化相吻合，提示高負荷劑量HIIT在加重腎臟纖維化的同時未促進腎小管EMT進程。高強度運動對腎臟EMT的影響鮮有報道，在針對心臟的研究中，Aschar等[29]發(fā)現(xiàn)，小鼠高強度耐力訓(xùn)練促進心房纖維化，但肌成纖維細胞數(shù)量并未增多，Benito等[26]證實，16周劇烈運動誘導(dǎo)健康大鼠心臟纖維化，然而停訓(xùn)8周后則完全逆轉(zhuǎn)。據(jù)此推斷，高強度運動誘導(dǎo)的與疾病造成的纖維化存在本質(zhì)區(qū)別，運動性腎臟纖維化的發(fā)生機制可能與運動性心肌纖維化類似并同樣具有可逆性特征，若及時停訓(xùn)或降低訓(xùn)練負荷，腎臟纖維化程度將得以緩解，然而這一假設(shè)尚需實驗驗證。

3.3 對HIIT作用的辯證審視

HIIT對于CVD的心臟效應(yīng)尚未明確，饒有興趣的是，多數(shù)針對CVD患者的研究以及臨床Meta-分析均證實HIIT的效果與傳統(tǒng)有氧運動相似[15， 16]，而動物實驗卻結(jié)論不一[10-12]。通過分析發(fā)現(xiàn)，人體試驗多采用4～20 min/d、2～3 d/w的低負荷劑量，而動物實驗則為了保證研究設(shè)計的嚴謹性，選擇與有氧運動相匹配的高負荷劑量（50～60 min/d、 4～5 d/w），可見HIIT的健康效應(yīng)與負荷劑量有關(guān)。Holloway等[10， 13]以及課題組前期研究[12]同樣證實了高負荷劑量HIIT對CVD大鼠的有害作用，本研究設(shè)計了兩種負荷劑量模式并進一步發(fā)現(xiàn)，在維持運動強度不變的前提下，降低負荷劑量則出現(xiàn)與SHR-hiHIIT組截然不同的結(jié)果，因此我們認為，HIIT方式本身并無不妥，針對不同生理狀況進行合理的負荷安排是HIIT能否產(chǎn)生良性適應(yīng)的關(guān)鍵。處于健康狀態(tài)的人或?qū)嶒瀯游?，代償?或恢復(fù)能力較強，故不同負荷劑量HIIT均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良性適應(yīng);然而疾病狀態(tài)下（尤其是CVD），由于各器官機能下降，長期高負荷劑量HIIT導(dǎo)致機體處于過度訓(xùn)練狀態(tài)并造成組織損傷，這在過量運動誘導(dǎo)心臟適應(yīng)不良的多項研究中亦得到印證[26， 30]。需要提及的是，由于人類具有意識和主觀能動性，HIIT的趣味性和刺激性對CVD患者而言更易接受[30]，但長期反復(fù)高強度跑臺被動運動則易造成動物身心應(yīng)激并進一步加重病情[31]。本研究中SHR-hiHIIT組大鼠即處于慢性應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，血清皮質(zhì)酮升高近3倍，Benghuzzi等證實[32]，持續(xù)超生理水平皮質(zhì)酮能夠損害腎臟結(jié)構(gòu)與功能。此外，SHR-hiHIIT組血壓呈現(xiàn)“雙相反應(yīng)”特征（先下降后升高），這與該組負荷劑量隨訓(xùn)練時間遞增的趨勢相吻合，進一步證實HIIT的作用存在負荷劑量依賴性，表明針對CVD存在“負荷閾值”（安全上限），超出閾值將產(chǎn)生負面影響。Benito等[26]等針對心肌纖維化的研究證實，高強度運動在康復(fù)初期能夠促進心臟生理適應(yīng)，而長期心臟超負荷則最終引起心臟病理性重塑。總之，本研究結(jié)果提示，高血壓腎病患者以HIIT作為運動康復(fù)方式時應(yīng)采取低負荷劑量。

4 結(jié)論

長期HIIT對高血壓腎病大鼠的健康效應(yīng)呈現(xiàn)負荷劑量依賴性，其機制與不同負荷劑量HIIT對TGF-β1/Smad信號途徑介導(dǎo)ECM代謝和EMT的調(diào)控存在差異有關(guān)，其中低負荷劑量HIIT通過促進ECM降解、降低ECM合成并抑制腎小管EMT減輕腎臟纖維化，而高負荷劑量HIIT則通過抑制ECM降解（但對ECM合成無影響）加重腎臟纖維化;此外，高負荷劑量HIIT并未進一步促進EMT，因此運動誘導(dǎo)的腎臟纖維化可能具有可逆性特征。

參考文獻：

[1]Mills KT， Stefanescu A， He J. The global epidemiology of hypertension[J]. Nat Rev Nephrol，2020， 16（4）：223-237.

[2]Sun HJ. Current opinion for hypertension in renal fibrosis[J]. Adv Exp Med Biol， 2019（1165）：37-47.

[3]Hu HH， Chen DQ， Wang YN， et al. New insights into TGF-β/Smad signaling in tissue fibrosis[J]. Chem Biol Interact，2018（292）：76-83.

[4]Zhou J， Chen XM， Liu SW， et al. Effects of Biejia Ruangan Tablet-containing serum on matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in cultured renal interstitial fibroblasts[J]. Chin J Integr Med，2015， 21（2）：152-156.

[5]MacKinnon HJ， Wilkinson TJ， Clarke AL， et al. The association of physical function and physical activity with all-cause mortality and adverse clinical outcomes in nondialysis chronic kidney disease：a systematic review[J]. Ther Adv Chronic Dis，2018， 9（11）：209-226.

[6]Heiwe S， Jacobson SH. Exercise training in adults with CKD：a systematic review and meta-analysis[J]. Am J Kidney Dis，2014， 64（3）：383-393.

[7]Thompson S， Wiebe N， Padwal RS， et al. The effect of exercise on blood pressure in chronic kidney disease：A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. PLoS One，2019， 14（2）：e0211032.

[8]Taryana AA， Krishnasamy R， Bohm C， et al. Physical activity for people with chronic kidney disease：an international survey of nephrologist practice patterns and research priorities[J]. BMJ Open，2019， 9（12）：e032322.

[9]MacInnis MJ， Gibala MJ. Physiological adaptations to interval training and the role of exercise intensity[J]. J Physiol，2017， 595（9）：2915-2930.

[10]Holloway TM， Bloemberg D， da SML， et al. High intensity interval and endurance training have opposing effects on markers of heart failure and cardiac remodeling in hypertensive rats[J]. PLoS One， 2015， 10（3）：e0121138.

[11]范朋琦， 秦永生， 彭朋. 不同運動方式對自發(fā)性高血壓大鼠心臟重塑和運動能力的影響[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018， 45（23）：4341-4345.

[12]孟憲欣， 管澤毅， 葛吉生，等. 間歇運動干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠病理性心臟肥大：運動強度與健康效應(yīng)的關(guān)系[J]. 體育科學(xué)， 2019， 39（6）：73-82.

[13]Holloway TM， Bloemberg D， da SML， et al. High-intensity interval and endurance training are associated with divergent skeletal muscle adaptations in a rodent model of hypertension[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2015， 308（11）：R927-934.

[14]付常喜， 李平， 秦永生，等. 高強度間歇訓(xùn)練對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響[J]. 山東體育學(xué)院學(xué)報， 2020， 36（3）：75-82.

[15]Izadi MR， Ghardashi AA， Asvadi FM， et al. High-intensity interval training lowers blood pressure and improves apelin and NOx plasma levels in older treated hypertensive individuals[J]. J Physiol Biochem，2018， 74（1）：47-55.

[16]Aghaei BN， Ebrahim K， Maleki M， et al. Short-duration high-intensity interval exercise training is more effective than long duration for blood pressure and arterial stiffness but not for inflammatory markers and lipid profiles in patients with stage 1 hypertension[J]. J Cardiopulm Rehabil Prev，2019， 39（1）：50-55.

[17]Zhan M， Usman IM， Sun L， et al. Disruption of renal tubular mitochondrial quality control by Myo-inositol oxygenase in diabetic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol，2015， 26（6）：1304-1321.

[18]Tervaert TW， Mooyaart AL， Amann K， et al. Pathologic classification of diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol，2010， 21（4）：556-563.

[19]Peng CC， Chen KC， Hsieh CL， et al. Swimming exercise prevents fibrogenesis in chronic kidney disease by inhibiting the myofibroblast transdifferentiation[J]. PLoS One，2012， 7（6）：e37388.

[20]付常喜， 李平， 秦永生，等. 有氧運動抑制自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2020， 47（13）：2421-2425.

[21]Garber CE， Blissmer B， Deschenes MR， et al. American College of Sports Medicine position stand. Quantity and quality of exercise for developing and maintaining cardiorespiratory， musculoskeletal， and neuromotor fitness in apparently healthy adults：guidance for prescribing exercise[J]. Med Sci Sports Exerc，2011， 43（7）：1334-1359.

[22]Zubin Maslov P， Schulman A， Lavie CJ， et al. Personalized exercise dose prescription[J]. Eur Heart J， 2018， 39（25）：2346-2355.

[23]Aparicio VA， Tassi M， Nebot E， et al. High-intensity exercise may compromise renal morphology in rats[J]. Int J Sports Med，2014， 35（8）：639-644.

[24]Bongers C， Alsady M， Nijenhuis T， et al. Impact of acute versus prolonged exercise and dehydration on kidney function and injury[J]. Physiol Rep，2018， 6（11）：e13734.

[25]Wang S， Zhang Q， Wang Y， et al. Transforming growth factor β1 （TGF-β1） appears to promote coronary artery disease by upregulating sphingosine kinase 1 （SPHK1） and further upregulating its downstream TIMP-1[J]. Med Sci Monit， 2018（24）：7322-7328.

[26]Benito B， Gay-Jordi G， Serrano-Mollar A， et al. Cardiac arrhythmogenic remodeling in a rat model of long-term intensive exercise training[J]. Circulation， 2011， 123（1）：13-22.

[27]Cruz-Solbes AS， Youker K. Epithelial to mesenchymal transition （EMT） and endothelial to mesenchymal transition （EndMT）：role and implications in kidney fibrosis[J]. Results Probl Cell Differ，2017（60）：345-372.

[28]Bao C， Yang Z， Cai Q， et al. Incremental load training improves renal fibrosis by regulating the TGF-β1/TAK1/MKK3/p38MAPK signaling pathway and inducing the activation of autophagy in aged mice[J]. Int J Mol Med， 2019， 44（5）：1677-1686.

[29]Aschar-Sobbi R， Izaddoustdar F， Korogyi AS， et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα[J]. Nat Commun， 2015， 6（19）：1-35.

[30]Kwan BM， Stevens CJ， Bryan AD. What to expect when you′re exercising：An experimental test of the anticipated affect-exercise relationship[J]. Health Psychol，2017， 36（4）：309-319.

[31]Cook MD， Martin SA， Williams C， et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis[J]. Brain Behav Immun， 2013（33）：46-56.

[32]Benghuzzi H， Tucci M， Hughes J， et al. Glomerular response to adrenocortical hormone alone or in combination with selenomethionine[J]. Biomed Sci Instrum，2005（41）：74-79.