劉思佳， 趙圣國， 鄭 楠， 王加啟

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京 100193)

反芻動物瘤胃是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，具有高度競爭的復(fù)雜微生物群落，對動物的健康有重要的影響[1]。瘤胃中微生物菌群主要有細菌、真菌、古菌、原蟲、病毒和噬菌體等[2-3]。許多微生物緊緊地附著在瘤胃內(nèi)容物上[4]并可以分泌生物降解酶[5]。反芻動物攝取飼料，進入瘤胃后，微生物降解、發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物供宿主利用[6]，這些微生物在宿主的營養(yǎng)[7](如飼料和消化)、生理和免疫功能[8]方面發(fā)揮著重要作用。因此，研究反芻動物瘤胃中微生物菌群變化及其影響，對于反芻動物健康與產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。目前，瘤胃微生物群落的研究主要是描述其多樣性，而對群落功能和代謝的研究僅限于可培養(yǎng)微生物[9]。但是，瘤胃中大部分微生物是無法進行分離培養(yǎng)的[10]。某些微生物生長過程需要共培養(yǎng)細菌產(chǎn)生的信號和化學(xué)因子的刺激[11]，因此，研究瘤胃微生物群落的主要挑戰(zhàn)是缺乏適宜分離和培養(yǎng)技術(shù)[12]，并且能被培養(yǎng)的小部分微生物不能夠代表微生態(tài)的多樣性。宏基因組測序技術(shù)的發(fā)展克服了體外分離培養(yǎng)的困難，解決了純培養(yǎng)難題，使得對復(fù)雜微生物群落的研究成為可能[13]。宏基因組學(xué)已經(jīng)明顯增加了對于微生物多樣性的了解，為瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)解析提供了重要技術(shù)支撐[14]，但該技術(shù)在揭示活性微生物群落能力方面存在重要缺陷[15]。通過基于DNA的方法可以成功地識別微生物種類與基因，但鑒定的一些微生物可能已經(jīng)死亡或處于代謝失活的狀態(tài)[16]，無法區(qū)分識別實際負責(zé)代謝的微生物。Gomez-Silvan等[17]在測定厭氧消化池中厭氧消化過程中觀察到，RNA測序結(jié)果中古細菌顯示出更高的多樣性，但DNA測序結(jié)果中細菌顯示出更高的多樣性，β多樣性分析顯示微生物DNA和RNA測序結(jié)果之間的群落組成存在顯著差異。宏基因組學(xué)可描繪特定環(huán)境中微生物群落的遺傳基因藍圖，但轉(zhuǎn)錄組學(xué)可鑒定在某些生理條件下具有表達活性的微生物及其功能基因[18]。為了描述微生物群落中具有代謝活性的成員，基于RNA的群落分析更合適，因為細胞產(chǎn)生的RNA的量與細菌的生長活性直接相關(guān)[19]，RNA尤其是mRNA更能代表具有活性的細胞或具有代謝活性的細胞信息[17]。因此，用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法來測定活性微生物群落信息，獲得微生物之間潛在的協(xié)作關(guān)系并進行功能分析，對反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵調(diào)控具有重要意義。但是，這一方法最重要的前提條件需要高效的、高質(zhì)量的RNA提取技術(shù)。RNA非常不穩(wěn)定，很容易被細胞內(nèi)或環(huán)境中的RNA酶降解，因此從樣本中提取高質(zhì)量的RNA比提取DNA困難得多。瘤胃內(nèi)容物成分復(fù)雜，微生物種類繁多，彼此之間又形成了緊密的合作共生關(guān)系[20]，在RNA 提取方法中對樣品處理至關(guān)重要，有待于進一步優(yōu)化改良。本研究目的是優(yōu)化RNA提取過程中瘤胃液前處理方法，提高瘤胃微生物RNA數(shù)量與質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液采集 采集1頭瘺管荷斯坦奶牛(550±23) kg 瘤胃液，奶牛日糧組成：苜蓿干草17.3%，玉米青貯18.7%，豆粕11.3%，菜粕4.2%，棉粕2.1%，膨化大豆2.1%，甜菜渣4.2%，全棉籽10.4%，玉米25.6%，食鹽0.5%，預(yù)混料3.6%。

1.1.2 主要試劑及儀器 液氮，RNA 保護液(Invitrogen)，三氯甲烷(北京試劑)，異丙醇(北京試劑)，無水乙醇(北京試劑)，RNase-Free 水(TIANGEN)；液氮冷凍研磨儀(Retsdi-Alleel-5,CryoMill,Retsch Gmbll)，Trizol(Invitrogen)，高通量組織研磨儀 (Retsch, Haan,TL2020)，安捷倫2100生物分析儀(2100,Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, 加拿大),RNA 6000納米試劑盒(Agilent Technologies),水浴鍋(Thermomixer comfort,EPPENDORE),離心機(3-18K，Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液前處理 瘤胃液經(jīng)6層紗布過濾去除固體飼料顆粒，進行3種不同的處理：①取過濾后的瘤胃液24 mL(每管4 mL,共6管)迅速置于液氮中冷凍保存；②將過濾后的瘤胃液離心(12 000×g,5 min)，棄上清，收集瘤胃菌體，迅速置于液氮中冷凍保存；③取離心后瘤胃菌體加入5倍體積RNA保護液，將瘤胃菌體重懸，常溫保存。將液氮中冷凍保存的瘤胃液置于室溫下進行解凍，解凍后離心(12 000×g,5 min)，棄上清收集瘤胃菌體。將加入RNA 保護液的樣品離心(12 000×g,5 min)，棄上清收集瘤胃菌體。將液氮冷凍保存的瘤胃菌體、液氮冷凍保存的瘤胃液、解凍離心后收集的菌體和RNA保護液離心收集的菌體，利用液氮冷凍研磨儀進行破碎，(研磨破碎樣品時，整個過程中樣品要一直處于液氮環(huán)境下)，條件為加入1顆20 mm鋼珠和10顆5 mm鋼珠，研磨5 min后立刻加入5 mL Trizol,充分混勻進行下一步試驗。取液氮冷凍保存的瘤胃菌體，加入5 mL Trizol后利用高通量組織研磨儀常溫研磨，振動頻率1 800/min，研磨60 s。 試驗共優(yōu)化4個前處理條件，組合形成5個試驗處理組(A、B、C、D、E)，見表1。

表1 瘤胃液樣品前處理方法

1.2.2 總RNA提取與質(zhì)量評定 加入Trizol的樣品在室溫放置5 min，添加總體積0.2倍體積的三氯甲烷，渦旋混勻15 s，室溫放置3 min，離心(12 000×g,4 ℃,15 min)，取上層水相到新的離心管中，并添加與上層水相等量的冰異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10 min，或-20 ℃放置1 h后離心(12 000×g,4 ℃,15 min)。倒出上清，添加與異丙醇等量的冰75%乙醇(75%乙醇使 用RNase-Free水配制，此試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用)，輕輕將整塊沉淀吹起懸浮(此處千萬注意不要將 RNA沉淀吹散，因為RNA吹散后很難通過離心重新聚集在一起)，離心(7 500×g,4 ℃, 10 min)，棄乙醇溶液。室溫放置5～10 min，直至干燥。加入沒有RNA酶的水 100 μL(可根據(jù)需要增加或減小體積)，水浴(55～60 ℃)加熱10～15 min使RNA更好地溶解。使用安捷倫2100生物分析儀和RNA 6000納米試劑盒評估RNA濃度和完整性。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用SAS方差分析法對RNA 濃度和完整度進行差異統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA濃度

液氮環(huán)境下冷凍研磨破碎瘤胃菌體、瘤胃液和解凍后收集的瘤胃菌體，總RNA的濃度分別為783.67、773、1 048 ng/μL，差異不顯著(P>0.05)(圖1)。對比處理組B和E，瘤胃液樣品形式對RNA濃度影響沒有顯著差異(P>0.05)。對比處理組A和B，添加RNA保護液在冷凍研磨條件下得到的RNA濃度為65 ng/μL。液氮保存的樣品比RNA保護液保存的樣品提取的RNA濃度高91.8%，顯著高于RNA保護液保存的方式(P<0.05)。保存形式對RNA濃度影響有顯著差異(P<0.05)。對比處理組D和E，說明解凍處理對RNA濃度影響沒有顯著差異。對比處理組B和C，瘤胃菌體在常溫環(huán)境下研磨得到的RNA濃度為418.67 ng/μL。冷凍研磨比常溫研磨提取RNA濃度高46.6%，顯著高于常溫研磨的方法(P<0.05)。研磨溫度對RNA濃度影響有顯著差異。

圖1 瘤胃液不同前處理條件對總RNA 濃度的影響Fig.1 Effect of different pretreatment conditionson total RNA concentration

A:微生物菌體加入RNA保護液冷凍研磨; B:微生物菌體液氮保存冷凍研磨; C:微生物菌體液氮保存常溫研磨; D:瘤胃內(nèi)容物液氮保存解凍后收集菌體冷凍研磨; E:瘤胃內(nèi)容物液氮保存冷凍研磨，a～c字母不同表示差異顯著(P<0.05)

A：Freeze homogenization of Bacteria with RNA Protective Solution；B：Freeze homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；C：Room temperature homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；D：Liquid nitrogen and homogenization of rumen contents after liquid nitrogen storage and thawing；E：Freeze homogenization of rumen contents with liquid nitrogen, Significant difference in different representations of a-c letters (P<0.05)

2.2 總RNA完整度

對比處理組B和E，液氮環(huán)境下冷凍研磨破碎瘤胃菌體和瘤胃內(nèi)容物，總RNA RIN值分別為8.4 和9.4，差異不顯著(P>0.05)(圖2)。處理瘤胃液樣品形式對RNA完整度影響差異不顯著。對比處理組A和B，添加RNA保護液提取總RNA RIN值為2.8。液氮保存的樣品提取RNA完整度極顯著高于液氮保存的樣品(P<0.05)。處理保存形式對RNA完整度影響極顯著。對比處理組D和E，解凍后收集菌體提取RNA RIN值為 5.5。不解凍處理所提取的RNA完整度(P<0.05)顯著高于解凍處理，解凍處理對RNA完整度影響有顯著差異。對比處理組B和C，分別在常溫和液氮環(huán)境下破碎瘤胃菌體，RNA RIN值分別為8.4和8.3，差異不顯著(P> 0.05)，研磨溫度對RNA完整度影響差異不顯著。

圖2 瘤胃液不同前處理條件對總RNA 完整度的影響Fig.2 Effects of different pretreatment conditions on the integrity of total RNA A：微生物菌體加入RNA保護液冷凍研磨；B：微生物菌體液氮保存冷凍研磨；C：微生物菌體液氮保存常溫研磨；D：瘤胃內(nèi)容物液氮保存解凍后收集菌體冷凍研磨；E：瘤胃內(nèi)容物液氮保存冷凍研磨，a～d字母不同表示差異顯著(P<0.05)A：Freeze homogenization of Bacteria with RNA Protective Solution；B：Freeze homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；C：Room temperature homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；D：Liquid nitrogen and homogenization of rumen contents after liquid nitrogen storage and thawing；E：Freeze homogenization of rumen contents with liquid nitrogen, Significant difference in different representations of a-d letters (P< 0.05)

3 討 論

濃度和完整度是評價RNA的兩個重要指標。RIN值用來評估RNA的完整性，它是由核糖體條帶的比值和RNA樣品的整個電泳軌跡決定的[21]。RIN值為10表示一個完整的RNA樣本，RIN值大于8的樣本符合轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建要求，可進行下游試驗[22]。環(huán)境或胃腸道樣品的RNA很容易被RNA酶降解，它的提取是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。RNA酶廣泛而穩(wěn)定存在，耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌。在實驗中，要嚴格控制外源RNA酶的污染，同時也要最大限度地抑制內(nèi)源性RNA酶。本研究描述了不同的瘤胃液前處理方法對提取RNA濃度與完整度的影響，找到了一種分離提取高質(zhì)量、高代表性的瘤胃微生物RNA的快速有效方法。

本研究發(fā)現(xiàn)收集瘤胃內(nèi)容物或瘤胃微生物菌體得到的RNA濃度和完整度都沒有顯著差異。但是采集瘤胃微生物菌體需要采樣現(xiàn)場配置離心機，一方面氧氣可能導(dǎo)致厭氧微生物死亡，另一方面增加了采樣的難度。與本研究類似的是Poulseny等[23]在研究奶牛瘤胃中產(chǎn)甲烷菌時，利用直接將瘤胃內(nèi)容物于液氮中速凍的前處理方法。

本研究中解凍處理對RNA濃度影響沒有顯著差異,但是不解凍處理提取的RNA完整度顯著高于解凍處理RNA，這可能是由于解凍后，RNA酶恢復(fù)活性降解RNA降低了完整度。Dai等[24]提取瘤胃內(nèi)容物與瘤胃中未消化的纖維RNA時，利用將采集的樣品置于液氮速凍并保存的前處理方法。Shinkai等[25]分別提取瘤胃固相和瘤胃液相RNA時，利用將樣品直接在-80 ℃儲存的前處理方法。該處理與本研究所得結(jié)論一致。

RNA保護液是一種液態(tài)、無毒的組織保存試劑，可以防止RNA的降解。本研究中提取液氮冷凍保存的樣品所得RNA濃度和完整度均顯著高于由RNA保護液保存的樣品。出現(xiàn)這種差異的原因可能是RNA保護液具有偏好性。Xiang等[26]在提取瘤胃壁組織中的RNA時，將瘤胃壁組織樣品保存在RNA保護液中，提取RNA平均濃度為(333.9±143.4) (SD) ng/μL。Comtet-Marre等[27]提取瘤胃內(nèi)容物中的RNA時，將采集的瘤胃內(nèi)容物樣品與RNA保護液混合，帶回實驗室經(jīng)過離心處理后-80 ℃儲存，提取RNA的RIN值為9.4。在Mayte等[28]、Jiao等[29]和Schwab等[30]的研究中，皮膚與血清樣本、腸道黏膜樣品和小鼠腸道內(nèi)容物樣品均保存在液氮中。因此，瘤胃內(nèi)容物成分復(fù)雜，盡量對樣品進行液氮速凍，如果確實沒有速凍條件，可以用RNA保護液，但需要回實驗室后盡快低溫凍存。

研磨溫度對RNA濃度有顯著影響，但對RNA完整度影響不顯著。將樣品與TRIzol試劑混合，通過室溫珠磨破碎的方法，有效地裂解了瘤胃微生物。冷凍研磨的方法分離提取的總RNA濃度顯著高于室溫研磨的方法。TRIzol試劑可以抑制RNA酶的活性，保護微生物RNA的完整性，但瘤胃微生物未破裂前在室溫環(huán)境下，內(nèi)源RNA酶恢復(fù)活性降低了RNA濃度。低溫可以抑制微生物和核糖核酸酶的活性[31]。 Li等[32]、Tveit等[31]和Dai等[24]在提取RNA過程中，肝臟樣品和瘤胃壁樣品，泥炭塊和瘤胃內(nèi)容物均采用液氮冷凍研磨的方法進行破碎。與本研究結(jié)果一致，認為在液氮環(huán)境下冷凍研磨破碎瘤胃微生物是RNA提取的關(guān)鍵技術(shù)之一。

提取得到高質(zhì)量的瘤胃微生物RNA后，由于溶液中包含有g(shù)DNA、rRNA和一些無機離子物質(zhì)，并且RNA非常不穩(wěn)定，需要做進一步的純化和反轉(zhuǎn)錄處理。使用DNase酶去除gDNA，結(jié)合RNA純化試劑盒去除DNase酶、rRNA和無機離子物質(zhì)，得到高純度的RNA，之后轉(zhuǎn)錄得到穩(wěn)定的cDNA或直接對mRNA進行測序[33]。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域[18]，已顯示出相當(dāng)大的潛力[34]。我們的方法使獲得大量高質(zhì)量的RNA成為現(xiàn)實。對于瘤胃環(huán)境，該方法可用于研究微生物群落、日糧組成以及其他因素對瘤胃功能和基因表達的影響。

直接采集瘤胃內(nèi)容物后,液氮速凍并在不解凍處理條件下冷凍研磨的方法，所提取的RNA完整度和濃度較好，可用于后續(xù)宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)試驗。