李其利, 卜俊燕， 唐利華， 黃穗萍， 郭堂勛， 莫賤友

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

芒果與香蕉、柑橘、蘋果、葡萄并稱世界五大水果，有著“熱帶果王”的美譽(yù)[1]。中國(guó)芒果主要分布在廣西、海南、廣東、云南、四川、福建、貴州和臺(tái)灣8省區(qū)，2014年中國(guó)芒果種植面積17.32萬公頃， 總產(chǎn)量143.77 萬噸[2]。芒果炭疽病是芒果生長(zhǎng)期和采后的重要病害之一，在世界芒果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[3]，在芒果生長(zhǎng)期，可以造成高于10%的損失。炭疽菌有明顯的潛伏侵染現(xiàn)象，田間看似無病果實(shí)，常在后熟期和貯運(yùn)期發(fā)病造成爛果，嚴(yán)重影響芒果的采后貯藏，造成的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重，貯運(yùn)期損失一般為30%～50%，嚴(yán)重的高達(dá)100%[1]。本文從芒果炭疽病的癥狀、病原分類鑒定、生物學(xué)特性、侵染特性及致病機(jī)理等方面進(jìn)行綜述，為深入研究該病的發(fā)生流行規(guī)律、抗病材料的選育及該病的綜合防治提供參考。

1 芒果炭疽病的癥狀

芒果炭疽病在葉片、花序、果實(shí)和枝梢上都可發(fā)生，且癥狀較為復(fù)雜。葉片感病初期出現(xiàn)不規(guī)則的褐色病斑，伴有黃暈。病斑可繼續(xù)擴(kuò)大至不規(guī)則形、圓形，呈黑褐色。多個(gè)病斑相互融合形成大病斑，甚至葉片枯死。嫩葉感病后病斑稍微突起，部分穿孔。嫩枝受害產(chǎn)生黑色斑點(diǎn)并上下擴(kuò)展，嚴(yán)重的形成回枯癥狀，病斑以上部分枝葉壞死，病部出現(xiàn)許多小黑點(diǎn)?；ㄐ蚋胁『蟪霈F(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)，擴(kuò)展形成圓形、條形斑。感病嚴(yán)重的花序變黑枯死，花蕾脫落，枯死[4]。未熟果實(shí)感病后，產(chǎn)生黑褐色小斑點(diǎn)。若果柄、果蒂感病，則果實(shí)很快脫落。成熟果實(shí)感病初期產(chǎn)生黑褐色圓形斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)展至圓形或不規(guī)則形大病斑，中間凹陷。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑互相融合，果皮表面黑色。病部果肉初期變硬，后期變軟腐。潮濕天氣下，病部常產(chǎn)生淡紅色分生孢子堆。此外，在臺(tái)農(nóng)一號(hào)、白象牙等部分品種果實(shí)上發(fā)現(xiàn)的紅點(diǎn)病，最終被證實(shí)為不同癥狀的芒果炭疽病[5-6]。

2 芒果炭疽病病原學(xué)

2.1 芒果炭疽菌的分類鑒定

前人報(bào)道的芒果炭疽病的病原菌主要有兩種，一種是無性階段炭疽菌屬膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sace，另一種是尖孢炭疽菌ColletotrichumacutatumJ.H. Simmonds。膠孢炭疽菌屬于半知菌亞門，腔孢綱，黑盤孢目，炭疽菌屬(Colletotrichum)，有性階段為子囊菌門小叢殼菌Glomerellacingulata(Stenem.)Spauld. et.Schrenk，后者為小叢殼屬G.acutatum。兩者為害癥狀基本一致[7-8]，其中膠孢炭疽菌C.gloeosporioides為主要病原菌[9]。

炭疽菌分類鑒定主要采用形態(tài)學(xué)鑒定和多基因分子鑒定方法相結(jié)合，形態(tài)學(xué)鑒定是最傳統(tǒng)也最重要的區(qū)分手段。傳統(tǒng)分類學(xué)指標(biāo)有菌落培養(yǎng)特征，分生孢子、附著孢的形狀、大小，以及剛毛形態(tài)特征，分生孢子梗及產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)和大小，菌核、厚垣孢子的有無和形態(tài)特征[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，Damm等[11]運(yùn)用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)、肌動(dòng)蛋白基因(Actin gene-ACT)、幾丁質(zhì)合成酶A基因(chitin synthase A gene-CHS I)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyeeraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene-GAPDH)、β-微管蛋白基因(β-tubulin-TUB2)和histone3(HIS3)基因進(jìn)行聯(lián)合建樹分析，可將形態(tài)相似炭疽菌區(qū)分開來，并發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)新種，Crouch等[12]將ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2基因位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析，對(duì)形態(tài)上極難區(qū)分識(shí)別的復(fù)合群C.gramincola區(qū)分開，并引入6個(gè)新種。形態(tài)特征結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定炭疽菌屬真菌已成為發(fā)展趨勢(shì)(表1)。目前用于鑒定炭疽菌的基因位點(diǎn)中，不同基因位點(diǎn)可有效區(qū)分的種類不同，其中Apmat基因位點(diǎn)能較好區(qū)分炭疽菌屬真菌的大部分種，特別對(duì)于膠孢炭疽復(fù)合群，其單基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定結(jié)果與ITS、ACT、CHS、CAL、GAPDH、TUB2基因位點(diǎn)的聯(lián)合分析結(jié)果一致，可有效用于膠孢炭疽復(fù)合群的種類鑒定[13]。

根據(jù)現(xiàn)在的分類情況，膠胞炭疽菌是一個(gè)復(fù)合群，可分為22個(gè)種[24]，而尖孢炭疽菌也是一個(gè)復(fù)合群，可分為31個(gè)種[25]。目前世界上已報(bào)道的芒果炭疽病的病原菌有12種(表2)。Lima等[23]從巴西東北部的芒果上分離出炭疽菌，聯(lián)合 ACT、TUB2、CAL、GAPDH、GS、ITS六個(gè)基因分析，得到芒果炭疽菌的5個(gè)種類C.asianum、C.fructicola、C.tropicale、C.dianesei、C.karstii，其中C.dianesei是一個(gè)新種。Vieira等[26]從巴西伯南布哥州芒果中分離出炭疽菌，聯(lián)合ACT、TUB2、CAL、CHS-1、GAPDH、ITS基因得到C.asianum、C.cliviae、C.dianesei、C.fructicola、C.karstii、C.tropicale、C.siamense和一個(gè)新種C.endomangiferae。Ismail等[27]聯(lián)合TUB2和HIS3基因從意大利芒果中鑒定出C.karstii、C.kahawae。Calderón等[28]聯(lián)合ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、ApMat五個(gè)基因位點(diǎn)，得到C.asianum、C.siamense、C.theobromicola(syn.C.fragariae)。 國(guó)內(nèi)報(bào)道的芒果炭疽菌種類較少，對(duì)采自攀枝花市仁和區(qū)的芒果葉斑病進(jìn)行分離和純化，采用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法及ITS序列分析法對(duì)其鑒定，確定主要為膠孢炭疽菌[29]；一種芒果果實(shí)上形成紅點(diǎn)癥狀的病害“芒果紅點(diǎn)病”，最初被認(rèn)為是一種新病害，后來經(jīng)過分離鑒定證實(shí)其為膠孢炭疽菌引起的炭疽病[5-6]；廣西的芒果炭疽病主要由3種炭疽菌引起，分別為亞洲炭疽菌(C.asianum)、暹羅炭疽菌(C.siamense)和果生炭疽菌(C.fructicola)，其中亞洲炭疽菌為優(yōu)勢(shì)種群[30]。海南臺(tái)農(nóng)芒果的采后炭疽病病原菌主要也為這3種炭疽菌，但其優(yōu)勢(shì)種和各種所占比例稍有不同[29]。最近有人在廣西發(fā)現(xiàn)C.scovillei也可引起芒果炭疽病[30]。我國(guó)芒果炭疽病的病原還未獲得詳細(xì)而系統(tǒng)的研究，一般都是對(duì)部分地區(qū)、部分分離來源(果實(shí)/葉片)的芒果炭疽病病原進(jìn)行鑒定。國(guó)外已報(bào)道芒果炭疽病可由多種炭疽菌引起，我國(guó)各芒果產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境差別大、品種多樣且產(chǎn)期不一致，病原種類也可能存在顯著差異。因此，有必要對(duì)我國(guó)以上八省(或自治區(qū))不同品種、不同地理來源以及不同發(fā)病部位的炭疽病進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，為芒果炭疽病的抗病育種、發(fā)生流行規(guī)律和田間防治提供參考。

表2 國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的芒果炭疽菌種類

2.2 生物學(xué)特性

芒果炭疽菌在培養(yǎng)特征、菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)等生物學(xué)特性方面表現(xiàn)出種內(nèi)多樣性[28，37-38]。芒果膠孢炭疽菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和孢子形成的適溫范圍分別為20～31 ℃、25～31 ℃。pH 5.0～8.0菌絲生長(zhǎng)較好；適宜產(chǎn)孢的pH值為3.5～4.5。螢光促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)作用最強(qiáng)，紅光和藍(lán)光抑制菌絲生長(zhǎng)[37]。附著胞形成的最適溫度為30 ℃，相對(duì)濕度在100%+水膜的條件下分生孢子萌發(fā)較好。分生孢子萌發(fā)的最適pH值為3.0～7.0，附著胞形成的最適pH值為3.0～6.0。胡美姣等[8]將尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌兩種芒果炭疽菌的生物特性進(jìn)行比較，指出尖孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢的最適溫度分別為26、24和28 ℃。膠孢炭疽菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢的最適溫度分別為28、32和28 ℃，中性及近中性條件最有利于兩種炭疽菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，pH值為3.0時(shí)有利于尖孢炭疽產(chǎn)孢，膠孢炭疽菌在pH值為7.0時(shí)產(chǎn)孢較多。含葡萄糖、蔗糖、果糖的培養(yǎng)基適宜于膠孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)，含淀粉的培養(yǎng)基利于其產(chǎn)生分生孢子；蔗糖、果糖有利于尖孢炭疽的菌絲生長(zhǎng)，蔗糖和麥芽糖利于其產(chǎn)生分生孢子。胡美姣等[8]比較了芒果膠孢炭疽和尖孢炭疽菌兩種之間菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及對(duì)藥劑敏感性等方面的差異，但并未比較不同溫度對(duì)其病斑擴(kuò)展的影響(表3)，而Lima等[38]比較了溫度對(duì)C.asianum、C.dianesei、C.fructicola、C.karstii和C.tropicale五種芒果炭疽菌在芒果果實(shí)上病斑擴(kuò)展的影響，結(jié)果顯示不同種芒果炭疽病菌最適發(fā)病溫度在25～30 ℃，病斑隨著溫度的增加而減小。其中C.asianum和C.dianesei的最適溫度分別是29.3 ℃和29.4 ℃，C.fructicola最適溫度是27.1 ℃，C.karstii和C.tropicale最適溫度分別是26.4、25.8 ℃。由于各芒果產(chǎn)區(qū)管理水平不一致，普遍存在打保險(xiǎn)藥、濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象，因此導(dǎo)致芒果炭疽菌對(duì)多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺等藥劑的敏感性存在顯著差異[39-42]。通過簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(Inter simple sequence repeat，ISSR)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)分析芒果炭疽菌遺傳多樣性[43-45]，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與芒果炭疽菌抗藥性有一定相關(guān)性[43]。監(jiān)測(cè)和分析芒果炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性，可防止或減緩芒果炭疽菌對(duì)殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，從而有效減少化學(xué)農(nóng)藥的用量。了解各地芒果炭疽菌的致病力強(qiáng)弱，有助于抗病材料的選育和抗病品種在田間的合理布局。然而，前人的研究多集中在芒果炭疽菌形態(tài)、致病力及遺傳多樣性等方面，很少有關(guān)于致病力變異機(jī)制的報(bào)道。

表3 不同種芒果炭疽菌生物學(xué)特性差異

注： “-”表示未測(cè)定

2.3 侵染特性

芒果炭疽病菌可在芒果枝條和爛葉等帶病組織上存活兩年以上[46]，分生孢子盤生于芒果表皮下，成熟后沖破表皮釋放分生孢子。芒果炭疽菌的分生孢子和菌絲體是該病的主要初侵染源[47]，在條件適宜時(shí)形成大量的分生孢子，分生孢子進(jìn)行侵染，以菌絲體在帶病枝梢、僵果及枯枝上越冬[3,48]。病菌還可在病殘?bào)w或果園的其他寄主上越冬，待來年氣溫回升，分生孢子可通過風(fēng)雨、昆蟲等方式在田間傳播，孢子萌發(fā)后可產(chǎn)生附著胞，侵染釘穿透角質(zhì)層并穿透表皮細(xì)胞壁侵入寄主體內(nèi)，雖然炭疽菌在10 ℃環(huán)境下可引起芒果葉片產(chǎn)生病斑[3]，但其最適溫度范圍在20～30 ℃。張賀等[41]研究發(fā)現(xiàn)，分生孢子在12～37 ℃范圍內(nèi)可萌發(fā)，形成附著胞的適宜溫度在24～28 ℃。接種后6 h，附著胞開始形成，9～12 h是形成的高峰期；分生孢子在相對(duì)濕度90%～100%范圍均可萌發(fā)且形成附著胞。相對(duì)濕度在88.4%以上最適宜病害發(fā)生，低于86%則發(fā)病率呈下降趨勢(shì)[49]。附著胞在形成后10～12 h后開始黑化并逐漸變?yōu)楹诤稚?，這一黑褐色斑點(diǎn)可能是侵染釘?shù)乃谖恢?，或者是附著胞和植物表面組織之間的連接點(diǎn)[50]，但Diéguez-Uribeondo等[51]認(rèn)為這個(gè)點(diǎn)與穿透孔是隨著侵染釘?shù)男纬梢约安≡诩闹骷?xì)胞內(nèi)的定殖生長(zhǎng)而產(chǎn)生。該病菌主要侵染嫩梢、嫩葉、花序和果實(shí)，病菌以侵染絲的形式在果實(shí)表皮潛伏，侵染初期無明顯癥狀，果實(shí)成熟或貯運(yùn)期間才逐漸表現(xiàn)癥狀[52]。分生孢子產(chǎn)生的附著胞附著力和抗性較強(qiáng)，對(duì)干燥、高溫、紫外線以及寄主組織表皮微生物的拮抗作用等逆境條件都具有較強(qiáng)的抗逆性，有利于其在寄主上長(zhǎng)期生存。當(dāng)病菌潛伏侵染到達(dá)一定程度后，是否發(fā)病主要取決于寄主植物的生理狀況[53]。因此，溫暖高濕、連續(xù)降雨，則病害迅速發(fā)展造成流行。目前世界上報(bào)道的芒果炭疽菌種類越來越多，不同芒果炭疽菌的侵染特性是否存在差異，需要進(jìn)一步研究。

2.4 致病機(jī)理

芒果膠胞炭疽菌侵染植物組織的過程中，產(chǎn)生成分較為復(fù)雜的植物毒素[54-55]，參與到芒果膠胞炭疽菌侵染植物組織的過程。該毒素在病原菌侵染過程中，可改變寄主植物組織細(xì)胞膜的通透性，有利于病原菌的侵入。此外，膠胞炭疽菌還會(huì)分泌果膠裂解酶、天冬氨酰蛋白酶、谷氨酸脫氫酶等一系列與致病相關(guān)的酶類，產(chǎn)生氨使環(huán)境pH值升高，并激發(fā)與致病相關(guān)的基因[56]。目前，已發(fā)現(xiàn)不同來源的芒果炭疽菌菌株對(duì)不同品種的芒果果實(shí)和葉子致病力存在顯著差異[57]，但其致病力變異的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。韋運(yùn)謝等[58-59]對(duì)芒果膠孢炭疽菌漆酶基因Lac1和Lac2的序列特征進(jìn)行探究，采用同源克隆、 SEFA-PCR 和 RT-PCR 技術(shù)對(duì)Lac1基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)所獲得的Lac1基因進(jìn)行了序列特征和預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析，也采用同源克隆和RT-PCR法獲得膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2。Lac1和Lac2基因具備真菌漆酶基因家族的序列特征，推測(cè)Lac1和Lac2基因可能與芒果炭疽菌的致病性有關(guān)。進(jìn)一步研究表明漆酶基因Lac1，不僅影響致病性，而且影響病原菌的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子、附著胞的形成、色素沉著、黑色素生物合成、胞外水解酶的分泌及外源營(yíng)養(yǎng)的利用等[60]。隨后，采用相同的方法克隆了芒果炭疽病菌小柱孢酮脫水酶基因SCD1[61]，內(nèi)切葡聚糖酶基因CgEg1B等基因[62]、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Cgglt1[63]，分析其序列特征、推測(cè)了其蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建了敲除載體，但其基因的功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。芒果膠孢炭疽中與致病相關(guān)的基因還有很多，如何快速挖掘與致病相關(guān)基因，并研究其功能是需要進(jìn)一步探討的問題。

3 展 望

炭疽菌屬真菌分類與鑒定常用的方法即傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類、分子生物學(xué)分類、次生代謝特異性等。每種分類方法都各有裨益，需采用多相分類，將形態(tài)學(xué)鑒定、多基因分子鑒定、次生代謝產(chǎn)物分析等方法相結(jié)合鑒定炭疽菌屬真菌，從而提高分類的準(zhǔn)確率。對(duì)于膠孢炭疽復(fù)合群(C.gloeosporioidesspecies complex)，由于Apmat單基因鑒定結(jié)果與多基因聯(lián)合分析鑒定結(jié)果一致，在通過ITS初步確定為膠孢炭疽菌后，可優(yōu)先考慮使用Apmat進(jìn)行分子鑒定。目前世界上報(bào)道的芒果炭疽病的病原菌有12種：C.asianum、C.fructicola、C.siamense、C.tropicale、C.dianesei、C.karstii、C.scovillei、C.grossum、C.cliviae、C.endomangiferae、C.kahawae、C.theobromicola(syn.C.fragariae)，中國(guó)已經(jīng)報(bào)道的芒果炭疽病病原有4種：C.asianum、C.fructicola、C.siamense、C.scoville。然而，前人一般都是對(duì)我國(guó)部分地區(qū)的芒果炭疽病的病原菌進(jìn)行分類鑒定。因此，全面了解我國(guó)芒果炭疽病的病原種類及優(yōu)勢(shì)種群，明確其致病力分化情況，可為深入研究該病的發(fā)生流行規(guī)律、抗病材料的選育和抗病品種在田間的合理布局提供參考；對(duì)我國(guó)芒果炭疽病菌的抗藥性進(jìn)行系統(tǒng)分析，可防止或減緩芒果炭疽菌對(duì)殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，從而有效減少化學(xué)農(nóng)藥的用量，也是研究芒果炭疽病綠色防控新策略、新方法和新藥劑的基礎(chǔ)。中國(guó)不同地區(qū)芒果炭疽病病原菌是否只有已報(bào)道的4種，其優(yōu)勢(shì)病原菌是否一致，這些不同種炭疽菌在生物學(xué)特性、侵染特性等方面是否存在差異？芒果炭疽病菌有潛伏侵染特性，如何快速檢測(cè)芒果炭疽病菌不同種類，并研究其帶菌情況與病害發(fā)生的關(guān)系，可為該病防治提供參考。中國(guó)不同地理來源的芒果炭疽菌致病力存在較大差異，其致病力變異與地理來源是否存在關(guān)聯(lián)，致病力分化及擴(kuò)散的分子機(jī)制如何？都是需要進(jìn)一步研究的問題。此外，國(guó)內(nèi)外關(guān)于芒果炭疽菌致病機(jī)理的報(bào)道較少，今后需要進(jìn)一步加強(qiáng)其致病機(jī)理研究，為芒果炭疽病的綠色防控提供參考。