王 琳， 李璐璐， 李志英， 常小娟

(1.西安醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

在長(zhǎng)期的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，人們總結(jié)出了豆科作物輪作、間作能夠增產(chǎn)的規(guī)律，但對(duì)其生理過(guò)程及機(jī)制知之甚少[1]。二十世紀(jì)初，科學(xué)家通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了豆科植物根瘤在固氮過(guò)程中會(huì)釋放H2，但在土壤中檢測(cè)到的H2量卻很少甚至沒(méi)有，因此推斷這種氫氣消失的現(xiàn)象可能與土壤中某一種或某一類微生物有關(guān)[2-3]。Mclearn等[4]確定土壤中的這類微生物可以氧化氫氣，并將這一類微生物命名為氫氧化細(xì)菌。加拿大圣瑪麗大學(xué)的董忠民教授在豆科植物共生固氮實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)氫氣對(duì)土壤的影響是和氫氧化細(xì)菌相關(guān)的，這種細(xì)菌會(huì)在根際土壤中形成可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)，或者通過(guò)抑制一些對(duì)植物生長(zhǎng)有害的物質(zhì)起到促生作用。豆科植物根瘤固氮釋放的H2及其依賴于H2而生長(zhǎng)的氫氧化細(xì)菌構(gòu)成了豆科植物根際所特有的微生物群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)植物根際土壤微生物以及植物病原微生物生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生有益影響[5-7]。開(kāi)展豆科作物根際氫氧化細(xì)菌的促生實(shí)驗(yàn)研究，有助于豐富具有促生作用的根際微生物資源，揭示與豆科作物的輪作、間作效益相關(guān)的分子基礎(chǔ)，為開(kāi)拓農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新思路。進(jìn)行豆科植物共生固氮放氫的研究必將豐富生物固氮學(xué)的內(nèi)容，并對(duì)土壤肥力和養(yǎng)分循環(huán)研究起到促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土樣取自陜西省銅川新區(qū)紫花苜蓿根際土壤。采用“S 形采樣法”在苜蓿田中選取5個(gè)采樣點(diǎn)，使用抖根法取樣：首先將植物的根部從土壤中輕輕挖出，然后輕輕抖落和根部相結(jié)合的部分土壤，再用無(wú)菌小刷子刷取，將刷得的土壤樣品混合在一起，過(guò)2 mm篩，將其分成3等份-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①M(fèi)SA無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 5.0 g，(NH4)2SO45.0 g，MgSO40.2 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2，121℃滅菌20 min。②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.1.3 主要試劑 瓊脂為日本分裝進(jìn)口，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 自動(dòng)高壓滅菌鍋(HVA-85，株式會(huì)社平山制作所)，電子天平(JY2002，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，生化培養(yǎng)箱(LRH-250F，上海奇欣科學(xué)儀器有限公司)，渦旋儀(QL-861，江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(TDL-5A，上海菲恰爾分析儀器有限責(zé)任有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 氫氧化細(xì)菌的分離 取10 g土樣轉(zhuǎn)移到裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，置于搖床中搖勻(180 r/min，30 min)。吸取懸浮液0.1 mL加入到0.9 mL無(wú)菌水中混勻，做一系列10倍梯度的稀釋，最終稀釋倍數(shù)為10-12。從每個(gè)梯度取0.1 mL土壤稀釋液于MSA無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基[8-9]上涂布，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。平板倒置于連續(xù)通氫裝置(電解水制氫，濃度為4.16×10-4～2.42×10-3mol/L)[10]中30 ℃培養(yǎng)14 d。

1.2.2 菌株氫化酶活性測(cè)定 篩選含有氫化酶的細(xì)菌常用的實(shí)驗(yàn)方法是TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)法[11]。滅菌的濾膜放置于MSA無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將分離的菌株點(diǎn)接到濾膜上再放入氣體循環(huán)培養(yǎng)體系中。待濾膜長(zhǎng)出明顯菌落后，室溫下在空氣黑暗的條件中10～20 min，觀察菌落可能出現(xiàn)的顏色變化；再放入通入氫氣的密閉容器中，室溫下放置10～20 min，觀察菌落顏色變化。在空氣中菌落顏色沒(méi)有變化，而在氫氣條件下變紅色的菌株具有氫化酶活性為陽(yáng)性，即為含氫化酶的細(xì)菌，每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.2.3 菌株自養(yǎng)能力的測(cè)定 利用氫氣作為唯一能源鑒定待測(cè)菌株是否進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，是比較嚴(yán)格的檢測(cè)氫氧化細(xì)菌的方法。①平板培養(yǎng)法：取氫化酶活性較高的菌株，制備菌懸液后涂布于MSA無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，無(wú)菌水涂布的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。將平板倒置于氣體循環(huán)培養(yǎng)體系中，連續(xù)培養(yǎng)2周，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。另一組培養(yǎng)基直接放置于空氣中，在室溫條件下連續(xù)培養(yǎng)2周，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，判斷菌株是否能以氫氣作為唯一能源進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)。②搖床培養(yǎng)法：將待測(cè)菌株接種到MSA液體培養(yǎng)基中，分成兩組。一組錐形瓶用無(wú)菌橡膠塞封口密閉，橡膠塞上裝有進(jìn)氣管和出氣管，用含氫氣的混合氣體將錐形瓶中的氣體置換，塞緊管口，30 ℃，120 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，隔2天將錐形瓶中氣體置換1次，培養(yǎng)1周。另一組錐形瓶中不通氫氣，30 ℃，120 r/min搖床好氧培養(yǎng)。每天對(duì)菌懸液取樣，721分光光度計(jì)560 nm波長(zhǎng)條件下，測(cè)量菌懸液的OD值，檢測(cè)氫氣對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 菌株的鑒定 ①細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化特征鑒定：挑選的16株細(xì)菌的形態(tài)和生理生化特征鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(8版)[12-13]中的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。②16S rDNA序列測(cè)定：使用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取16株菌株的基因組DNA，然后選擇細(xì)菌通用的引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[14]對(duì)16株細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR(50 μL)反應(yīng)條件如下：DNA模板2.0 μL，Reaction Buffer(5×) 10 μL，dNTPs 10 mmol/L，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 34 μL。PCR擴(kuò)增過(guò)程：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min，最終延伸72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，在GenBank中與已知的序列比對(duì)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，獲取菌株的分類地位和相應(yīng)菌株的GenBank登錄號(hào)。

1.2.5 小麥促生實(shí)驗(yàn) 然后選取飽滿、無(wú)蟲(chóng)害、大小相近的小麥種子，放入5倍于種子量的水中，輕輕攪拌15 min左右，30 ℃溫水浸泡6 h(浸泡時(shí)間合適，若時(shí)間太長(zhǎng)，種子將會(huì)進(jìn)行無(wú)氧呼吸，產(chǎn)生的乙醇會(huì)損傷種子，使發(fā)芽率降低；若時(shí)間太短，種子內(nèi)抑制物無(wú)法浸出)[15]，再用75%的乙醇處理1 min后，用無(wú)菌水沖洗去除乙醇，再用次氯酸鈉浸泡5 min，用無(wú)菌水多次沖洗干凈。將消毒的小麥種子置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中鋪有滅菌的濾紙)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放15粒小麥種子，上面覆蓋滅菌的濕潤(rùn)紗布，27 ℃暗處催芽2 d。將待測(cè)的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床震蕩培養(yǎng)(27 ℃，180 r/min，48 h)。挑選發(fā)芽狀況基本一致的小麥種子在15 mL相同濃度的菌懸液中放置3 h，在鋪有無(wú)菌濾紙的平板上繼續(xù)光照培養(yǎng)10 d，光暗時(shí)間分配為1∶1，觀察小麥的生長(zhǎng)情況，10 d后記錄小麥的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重和干重，滅活的菌懸液設(shè)置對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫氧化細(xì)菌的分離純化

在MSA無(wú)機(jī)鹽固體平板上30 ℃培養(yǎng)14 d后，挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)一步劃線純化，然后利用TTC試驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行氫化酶的定性檢測(cè)，得到45株氫化酶陽(yáng)性菌株，其中具有自養(yǎng)能力的16株(表1)，這些菌株具有氫化酶活性，并且在只有氫氣作為能源的情況下，在固體和液體培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)，判定這些菌株為氫氧化細(xì)菌，并于-80 ℃保藏備用。

表1 菌株氫化酶活性及自養(yǎng)能力檢測(cè)

續(xù)表1

注：在氫化酶活性實(shí)驗(yàn)中，“+”表示陽(yáng)性， “-”表示陰性，其中 “++”代表紅棕色，“+”代表粉紅色；在自養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，“+”表示菌株能夠自養(yǎng)生長(zhǎng)，“-”表示菌株不能進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征和生理生化特征鑒定 結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.2.2 16S rDNA序列分析 將測(cè)序得到的菌種序列提交給GenBank，獲取登錄號(hào)并進(jìn)行Blast序列比對(duì)，使用最大似然法對(duì)16株菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中1-0-19、2-3-6、3-0-15、3-1-17屬于微桿菌屬(Microbacterium)；1-2-3、1-2-9、2-2-16、2-3-1屬于節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)，其余菌株分類和GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表4。

表2 菌株的形態(tài)特征

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性，表3同

表3 菌株生理生化特征

續(xù)表3

表4 菌株的種屬劃分

續(xù)表4

2.3 菌株對(duì)小麥種子促生作用

各待測(cè)菌株制成的菌液浸泡小麥種子的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于對(duì)照，小麥根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)的生長(zhǎng)量都高于對(duì)照，小麥鮮重的增加量也都高于對(duì)照(表5、圖1、圖2)。

與對(duì)照相比，菌液1-0-19處理過(guò)的小麥根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重分別增加了25%、42%、48%，菌液1-1-2處理后分別增加79%、44%、59%，菌液1-2-3處理后分別增加112%、27%、70%，菌液1-2-9處理后分別增加122%、50%、82%，菌液1-3-2處理分別增加86%、69%、81%，菌液2-0-4處理分別增加49%、33%、73%，菌液2-1-4處理后分別增加了128%、55%、89%，經(jīng)菌液2-2-16處理后分別增加31%、87%、103%，菌液2-3-1處理后分別增加了84%、71%、66%，菌液2-3-6處理衙分別增加102%、66%、55%，菌液3-0-15處理后增加58%、67%、59%，菌液3-1-1處理后分別增長(zhǎng)為111%、73%、72%，菌液3-1-17處理過(guò)后分別增加81%、62%、59%，菌液3-3-10處理后分別增加了96%、73%、52%。

表5 菌株對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

注:圖中數(shù)值均為3次重復(fù)的平均值，“±”后面的數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)差

圖1 菌株對(duì)小麥種子根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of strain on wheat seed root and bud length

圖2 菌株對(duì)萌發(fā)小麥鮮重和干重的影響Fig.2 The effect of strains on fresh and dry weight of wheat germination

3 討 論

氫氧化細(xì)菌是一類兼性化能自養(yǎng)細(xì)菌，在無(wú)機(jī)培養(yǎng)條件下，能以氫氣做為能源物質(zhì)固定二氧化碳獲得能量，因此在分離氫氧化細(xì)菌時(shí)，通常在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中通入氫氣使氫氧化細(xì)菌得以富集。一般常用的方法有配氣法、液體培養(yǎng)系統(tǒng)和氣體循環(huán)培養(yǎng)體系三種[16-17]。其中配氣法和液體培養(yǎng)體系存在很多不足，比如氫氣濃度不穩(wěn)定，操作比較復(fù)雜并有一定的安全隱患。陳興都等[18]在Dong等[19]的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了能夠產(chǎn)生氫氣、利用氫氣的一套氣體循環(huán)培養(yǎng)體系，并且摸索出一系列在實(shí)驗(yàn)室條件下分離氫氧化細(xì)菌的方法。本研究利用氣體循環(huán)培養(yǎng)體系對(duì)氫氧化細(xì)菌進(jìn)行分離。利用氫氣進(jìn)行化能自養(yǎng)生長(zhǎng)是氫氧化細(xì)菌的一個(gè)分類指標(biāo)，因此可以利用這一特點(diǎn)對(duì)氫氧化細(xì)菌進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將礦質(zhì)鹽無(wú)機(jī)培養(yǎng)基作為微生物生長(zhǎng)的場(chǎng)所，在培養(yǎng)基中加入滅菌的土壤懸液，以提供氫氧化細(xì)菌生長(zhǎng)所需的一些微量元素，使培養(yǎng)基成分更加全面。

篩選氫氧化細(xì)菌常用TTC法和自養(yǎng)能力檢測(cè)方法。TTC法定性氫化酶的活性檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，但是試驗(yàn)中可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菌株既有較強(qiáng)的氫化酶活性，又能進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，就可以初步判定該菌株屬于氫氧化細(xì)菌。通過(guò)上述方法，從45株氫化酶活性陽(yáng)性菌株中篩選出16株具有自養(yǎng)能力的菌株。

通過(guò)生理生化特性對(duì)菌株的分類地位進(jìn)行初步判斷，16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果支持了菌株的生理生化鑒定結(jié)果，表明從苜蓿中分離得到的氫氧化細(xì)菌分別屬于微桿菌屬、類諾卡氏菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、氣微菌屬、白蟻菌屬、分枝桿菌屬、纖維菌屬、假黃單胞菌屬、粘著劍菌屬、葉桿菌屬。

豆科植物固氮過(guò)程釋放的氫氣會(huì)富集土壤中的氫氧化細(xì)菌，而氫氧化細(xì)菌會(huì)分泌一些物質(zhì)促進(jìn)作物生長(zhǎng)或者是抑制有害作物生長(zhǎng)的物質(zhì)來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)促生作用[20]。陳興都[21]在對(duì)大豆根際氫氧化細(xì)菌的促生研究中發(fā)現(xiàn)，菌株A11處理小麥?zhǔn)沟酶L(zhǎng)相對(duì)增加397.6%，玉米根長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)219.7%；菌株A06的處理使小麥根長(zhǎng)相對(duì)伸長(zhǎng)361%，處理過(guò)的玉米根長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)226.3%。本研究對(duì)促生作用進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明16株菌對(duì)小麥種子的萌發(fā)都有較明顯的促進(jìn)作用，在種子萌發(fā)的生長(zhǎng)指標(biāo)中，與其他指標(biāo)相比，菌株對(duì)根長(zhǎng)的伸長(zhǎng)有較明顯的促進(jìn)作用，其促生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。