孟佳慧， 劉國(guó)棟， 張亞南， 范世光， 趙蔓嘉， 傅煒昕*

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心一部，遼寧 沈陽 110001；2. 濟(jì)寧市中心血站，山東 濟(jì)寧 272000；3. 天津醫(yī)科大學(xué) 代謝病醫(yī)院，天津 300000)

NK細(xì)胞是一種具有天然細(xì)胞毒活性的免疫細(xì)胞，可直接對(duì)損害機(jī)體的病原體進(jìn)行免疫防御，無需抗原提呈即可靶向裂解癌細(xì)胞和病原體，介導(dǎo)機(jī)體抗感染和抗腫瘤反應(yīng)。NK細(xì)胞參與正常狀態(tài)的外周循環(huán)，除此之外，也可存在于脾、淋巴結(jié)、肝、肺、腸及子宮中[1]。當(dāng)機(jī)體受到外源性感染和腫瘤細(xì)胞侵襲時(shí)，NK細(xì)胞被活化，具有增殖和殺傷活性，能很好地清除受炎癥所累的壞死細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞[2-3]。NK細(xì)胞通過表達(dá)激活和抑制受體信號(hào)的平衡，識(shí)別和殺死應(yīng)激、轉(zhuǎn)化或病毒感染的細(xì)胞，并分泌各種效應(yīng)分子[4-5]。NK細(xì)胞受到激活后，自身也分泌促進(jìn)遷移的活性因子，而在個(gè)體差異、細(xì)胞亞群差異、以及NK細(xì)胞是否被激活等因素下，趨化因子受體的種類和水平具有很大的不同[6]。生物肽SP最初被發(fā)現(xiàn)為存在于神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織中的多肽，并且是傳遞疼痛、傷害感受和炎癥的神經(jīng)遞質(zhì)。SP可以在炎癥時(shí)促進(jìn)免疫細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)炎癥局部的免疫反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞向炎癥局部的遷移[7]。SP是細(xì)胞遷移的關(guān)鍵參與者，可以直接或通過誘導(dǎo)多種趨化因子及其受體或粘附分子發(fā)揮這種功能[8]。本研究以NK92-MI細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討SP對(duì)NK細(xì)胞的趨化遷移活性的直接或間接的影響，并通過測(cè)定SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞CCR7和CXCR4表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步討論SP促進(jìn)NK細(xì)胞遷移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 NK細(xì)胞株：NK-92MI細(xì)胞為IL-2非依賴型NK92細(xì)胞，1998年建系，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，用含12.5%的胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 P物質(zhì)(Sigma)，HE染色液(生工生物公司)，Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、Real-time PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa)，流式細(xì)胞抗體(FITC-CCR7單抗、PE- CXCR4單抗，BD)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(OLYMPUS)，微量紫外分光光度計(jì)(Sigma)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche 4800)，流式細(xì)胞儀FACSAria(BD)。

1.2 方法

1.2.1 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移力的影響 ①在24孔板下室加入不同濃度的SP，600 μL/孔，使其終濃度分別為10-12、10-10、10-8、10-6mol/L，并設(shè)置對(duì)照孔，以等體積的培養(yǎng)液替代SP；在Transwell上室加入8×105/mL的未經(jīng)SP處理的NK92-MI細(xì)胞懸液，100 μL/孔。②將NK92-MI細(xì)胞用不同濃度SP(10-12、10-10、10-8、10-6mol/L)作用24 h，在24孔板下室分別加入趨化因子CXCL12/CCL21，600 μL/孔，使其終濃度為60 ng/mL；在Transwell上室加入8×105/mL的經(jīng)SP處理的NK92-MI細(xì)胞懸液，100 μL/孔。設(shè)置對(duì)照組，上室為未經(jīng)SP處理的NK92-MI細(xì)胞，下室為CXCL12/CCL21。③將接種好的24孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。孵育結(jié)束后,取出培養(yǎng)板，棄去上、下室的液體，然后用棉簽輕輕擦拭Transwell小室的上表面，再用PBS清洗小室的上、下表面。用4%多聚甲醛固定15 min；對(duì)小室進(jìn)行HE染色后，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算趨化指數(shù)(CI)。計(jì)算公式：CI=實(shí)驗(yàn)組每鏡下視野中細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組每鏡下視野中細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 Real-time PCR法測(cè)定SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體CCR7和CXCR4 mRNA表達(dá)的影響 ①引物設(shè)計(jì):CR7和CXCR4的引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物公司合成，引物序列見表1。②Real-time PCR：將NK92-MI細(xì)胞用各濃度SP(10-12mol/L～10-6mol/L)作用6 h后收集細(xì)胞，用異硫氰酸胍(Trizol)法提取總RNA。RT反應(yīng)體系為20 μL(去DNA反應(yīng)總RNA液10.0 μL、5×Prime Script BufferⅡ 4.0 μL、Prime Script RT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。PCR反應(yīng)體系為20 μL(SYBR Premix ExTaqII 10.0 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、cDNA 2.0 μL、dH2O 6.4 μL)；PCR反應(yīng)為2步法：95 ℃、30 s(預(yù)變性)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s(40個(gè)循環(huán))。應(yīng)用羅氏4800 Real-time PCR System進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin做內(nèi)參基因，用2-△△Ct法比較實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組的倍數(shù)差異，計(jì)算公式：△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct，mRNA相對(duì)表達(dá)= 2-△△Ct。

表1 Real-Time PCR 用引物

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7和CXCR4表達(dá)的影響 將NK92-MI細(xì)胞用各濃度SP(10-12～10-6mol/L)作用24 h后收集細(xì)胞。用PBS緩沖液洗滌兩次，將細(xì)胞重懸至EP管中，并將SP處理的NK92-MI細(xì)胞分為兩管，分別加入FITC-CCR7抗體5 μL、PE-CXCR4抗體20 μL，室溫避光孵育30 min?？贵w處理結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，每次以10 000 r/min離心3 min，洗去未結(jié)合抗體。將每管細(xì)胞用200 μL 4%多聚甲醛重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK92-MI細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CCR7和CXCR4的陽性細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移活性的影響

2.1.1 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移能力的影響 在10-12～10-10mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著SP濃度的增加，其促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞遷移作用逐漸增強(qiáng)，1010mol/L濃度時(shí)趨化指數(shù)達(dá)最大值(P<0.01)，隨濃度繼續(xù)增加，SP促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞遷移能力逐漸減弱，結(jié)果如表2、圖1所示。

圖1 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移能力的影響(HE染色transwell圖)Fig.1 Effects on migration ability of NK92-MI cells by SP (HE staining picture of transwell)

表2 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移能力的影響

注：*與對(duì)照組相比P<0.05，**與對(duì)照組相比P<0.01，下表同

2.1.2 SP增強(qiáng)趨化因子CCL21/CXCL12對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化作用 在低濃度(10-12～10-10mol/L)范圍內(nèi)，SP可促進(jìn)趨化因子CCL21/CXCL12對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化作用，且隨SP濃度的增加促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，在10-10mol/L濃度時(shí)，SP促進(jìn)作用最強(qiáng)；SP濃度繼續(xù)增加，SP促進(jìn)趨化因子CCL21/CXCL12對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化作用又有所回降，結(jié)果如表3、圖2所示。

表3 SP增強(qiáng)趨化因子CCL21/CXCL12對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化作用Table 3 SP enhanced chemotaxis of CCL21/CXCL12 on NK92-MI cells

圖2 SP增強(qiáng)趨化因子CCL21/CXCL12對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化作用(HE染色transwell圖)

2.2 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體CCR7和CXCR4 mRNA表達(dá)的影響

SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞表達(dá)的CCR7和CXCR4兩種趨化因子受體mRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用。

在濃度范圍為10-12～10-6mol/L時(shí)，SP刺激NK92-MI細(xì)胞6 h，均可明顯促進(jìn)CCR7 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，且隨著SP濃度的增高，其mRNA表達(dá)水平也增高(圖3A)。在濃度范圍為10-10～10-6mol/L時(shí)，SP刺激NK92-MI細(xì)胞6 h，均可明顯促進(jìn)CXCR4 mRNA的表達(dá)(P<0.01)；僅在濃度為10-12mol/L時(shí)，其mRNA的表達(dá)無明顯增高(圖3B)。

2.3 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體CCR7和CXCR4膜表達(dá)的影響

SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞表達(dá)的CCR7和CXCR4兩種趨化因子受體膜表達(dá)具有不同的效應(yīng)。

濃度范圍為10-12～10-6mol/L的SP作用24 h，CCR7陽性細(xì)胞百分率隨著SP濃度的增高而增高，10-8mol/L和10-6mol/L濃度的SP可明顯促進(jìn)CCR7受體膜表達(dá)(P<0.05)(結(jié)果見圖4A、圖4C)。濃度范圍為10-12～10-6mol/L的SP作用24 h，CXCR4陽性細(xì)胞百分率均高于對(duì)照組，且隨著SP濃度的增高，具有先增高后回降的趨勢(shì)，10-10mol/L和10-8mol/L濃度組，CXCR4陽性細(xì)胞百分率有顯著增高(P<0.01、P<0.05)(圖4B、4C)。

圖3 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體CCR7和CXCR4 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects on the mRNA expression of CCR7 and CXCR4 in NK92-MI cells by SPA: CCR7 mRNA的相對(duì)表達(dá); B: CXCR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)；*與對(duì)照組相比P<0.05，**與對(duì)照組相比P<0.01，下圖同A： Relative expression of CCR7 mRNA；B： Relative expression of CCR7 mRNA；*Compared with the control group P<0.05，** Compared with the control group P<0.01，same the follow

圖4 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體CCR7和CXCR4膜表達(dá)的影響Fig.4 Effects on the expression of chemokine CCR7 and CXCR4 in NK92-MI cells by SP

A： CCR7的表達(dá)(陽性細(xì)胞百分率)；B： CXCR4的表達(dá)(陽性細(xì)胞百分率)；C： CCR7和CXCR4 表達(dá)的流式圖

A： The percentage of CCR7+cells in NK92-MI cells; B： The percentage of CXCR4+cells in NK92-MI cells;C： FACS histograms of the expression of CCR7 and CXCR4

3 討 論

生物肽SP屬于速激肽類，是主要由神經(jīng)元分泌的高度保守的11個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。SP廣泛分布于機(jī)體內(nèi)，并由多種體內(nèi)細(xì)胞分泌，可介導(dǎo)多種生理和病理活動(dòng)[9]。 SP可參與傳導(dǎo)體內(nèi)疼痛感受，擴(kuò)張血管、參與呼吸道、輸尿管及膀胱平滑肌生理功能的調(diào)節(jié)，與此同時(shí)，SP也參與炎癥的局部反應(yīng)，并可參與炎癥局部多種免疫細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)；SP能通過促進(jìn)分泌可溶性調(diào)節(jié)因子的方式參與免疫調(diào)節(jié)，多種免疫細(xì)胞參與調(diào)節(jié)并促進(jìn)免疫功能[10]。SP調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖率和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，神經(jīng)源性炎癥則是基于SP對(duì)免疫細(xì)胞的募集，SP能將白細(xì)胞募集到傷害感受器的外周末端，并釋放出導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛的神經(jīng)活性介質(zhì)，這也是許多病理過程的關(guān)鍵組成部分[11]。

NK細(xì)胞為固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞，能裂解靶細(xì)胞；成熟NK細(xì)胞可分布于外周循環(huán)血、脾、肺及肝等器官中，具有較強(qiáng)的遷移活性[1]。在機(jī)體遭受細(xì)菌、病毒侵襲和癌細(xì)胞擴(kuò)散時(shí)，NK細(xì)胞可遷移至反應(yīng)部位。NK細(xì)胞的再循環(huán)、分布和對(duì)各個(gè)器官的依賴主要取決于器官特異性的趨化因子[12-13]。趨化因子受體的表達(dá)和相應(yīng)的NK細(xì)胞趨化反應(yīng)可以在細(xì)胞因子介導(dǎo)下進(jìn)行，并受到它的調(diào)節(jié)，因此表明它們可能更好地歸巢于相應(yīng)配體表達(dá)的腫瘤位點(diǎn)[14]。研究表明，NK細(xì)胞的遷移活動(dòng)受多種因素調(diào)控，能迅速遷移至病變部位，在炎癥感染治療、腫瘤疾病防御、應(yīng)激保護(hù)和正常免疫調(diào)控中起一定作用[15-17]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要集中在NK細(xì)胞本身的趨化研究上，而生物肽SP對(duì)NK細(xì)胞遷移活性的研究比較少。前期研究通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SP對(duì)NK細(xì)胞亞群分布的影響，并體外研究了SP對(duì)小鼠脾NK細(xì)胞遷移及趨化因子受體表達(dá)水平的調(diào)控作用[18]。本研究中使用NK92-MI細(xì)胞，具有與人NK細(xì)胞相似的表面分子和功能特征，表型為CD56brightCD16+。以NK92-MI細(xì)胞為研究對(duì)象，意在進(jìn)一步研究和討論SP促進(jìn)NK細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。

SP作為生物肽類物質(zhì)，在炎癥時(shí)具有募集免疫細(xì)胞的功能[8]。首先采用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移活性的影響，結(jié)果表明不同濃度SP均能促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的遷移活動(dòng)，說明SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞有直接的趨化作用，且SP能協(xié)同增強(qiáng)趨化因子CCL21(CCR7的配體)或CXCL12(CXCR4的配體)對(duì)NK92-MI細(xì)胞的趨化活性，這一作用可能通過增強(qiáng)NK92-MI細(xì)胞表面相應(yīng)趨化因子受體的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

目前的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)趨化因子受體的表達(dá)是有爭(zhēng)議的，可能是受到NK細(xì)胞來源和不同實(shí)驗(yàn)方法的影響。大部分靜止的細(xì)胞很少表達(dá)CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8及CCR9[19]；NK細(xì)胞亞群對(duì)趨化因子受體表達(dá)具有差異，CD56brightNK細(xì)胞通過CCR7靶向遷移至淋巴結(jié)，優(yōu)先表達(dá)CXCR3，并且與CD56dimNK細(xì)胞相比具有更高的CXCR4表達(dá)水平，CD56dimNK細(xì)胞則獨(dú)特地表達(dá)CXCR1，ChemR23和CX3CR1[20]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞能夠表達(dá)較低水平的CXCR2和CXCR3，表達(dá)較高水平的CXCR1、CXCR4和CX3CR1[21]。機(jī)體遭受炎癥侵襲時(shí)，CCR7具有重要的招募NK細(xì)胞抵御炎癥的功能，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，病原體環(huán)境可誘發(fā)抗原提呈細(xì)胞表達(dá)IL-18，而富含IL-18的環(huán)境能促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)CCR7，對(duì)趨化因子CCL19和CCL21所致的遷移作用具有更好的反應(yīng)性[22]。CXCR3和CXCR4可表達(dá)于NK細(xì)胞、活化T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和癌細(xì)胞等[23-24]。CXCR4在次級(jí)淋巴組織中白細(xì)胞歸巢及炎癥部位的募集中起重要作用，且受局部CXCL12濃度的影響[25-26]?；谀壳耙延械难芯浚肦eal-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)趨化因子受體CCR7和CXCR4 mRNA表達(dá)和膜表達(dá)。濃度為10-12～10-6mol/L的SP作用NK92-MI細(xì)胞，其CCR7 mRNA的表達(dá)均顯著增高；CCR7的膜表達(dá)與mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致，在10-8mol/L和10-6mol/L兩個(gè)濃度組，CCR7的膜表達(dá)明顯增高。濃度為10-10～10-6mol/L的SP均能明顯促進(jìn)CXCR4 mRNA的表達(dá)；且在10-10mol/L和10-8mol/L兩個(gè)濃度組，SP能明顯促進(jìn)CXCR4的膜表達(dá)，SP增加趨化因子受體CXCR4膜表達(dá)的變化趨勢(shì)與其mRNA水平的變化基本一致。SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)的影響與SP對(duì)其遷移能力的作用趨勢(shì)不完全一致，提示可能存在有各趨化因子受體的競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)，CCR7和CXCR4可能部分參與了SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞遷移的間接調(diào)控作用，還有其他趨化因子受體可能協(xié)同作用于SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞的遷移活性的調(diào)控。