牛夏憶， 韓茂椿， 李 淼， 陳云雨， 劉曉平

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，安徽 蕪湖 241002)

高度活化的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，已經(jīng)成為肺癌、肝癌、乳腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病等多種腫瘤分子靶向治療的理想靶標(biāo)之一[1-3]。β-catenin作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面可與E-cadherin相互作用，參與細(xì)胞連接的形成，另一方面通過(guò)與Lef1(lymphoid enhancer factor 1)的βBD結(jié)構(gòu)域(β-catenin binding domain)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)相互作用，促進(jìn)β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(β-catenin responsive transcription, CRT)的形成，啟動(dòng)原癌基因的大量表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化[4-5]。β-catenin主要包括3個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，其N端約含130個(gè)氨基酸，有多個(gè)蘇(絲)氨酸磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于β-catenin的泛素化降解具有重要作用。C端約含100個(gè)氨基酸，含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，是重要的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。中間結(jié)構(gòu)域是核心結(jié)構(gòu)域，主要由12個(gè)連續(xù)重復(fù)的犰狳蛋白重復(fù)片段(armadillo repeats, 138～686 aa)組成，這些犰狳蛋白重復(fù)片段互相折疊，可形成狹長(zhǎng)的螺旋狀空間結(jié)構(gòu)，幾乎介導(dǎo)了與Wnt信號(hào)通路中所有重要大分子蛋白的相互作用，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和原癌基因表達(dá)的調(diào)控，對(duì)β-catenin生物學(xué)功能的發(fā)揮尤為重要[4-5]。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)的生長(zhǎng)、分化、腦(骨)轉(zhuǎn)移和耐藥與復(fù)發(fā)的過(guò)程中，高度活化的β-catenin/Lef1相互作用發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用[6-10]。另外，Spranger等[11-12]在黑色素瘤抵抗免疫治療的分子機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin的高表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞抵抗免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的重要機(jī)制之一，但β-catenin如何在腫瘤微環(huán)境中調(diào)控免疫抵抗和腫瘤干細(xì)胞分化的分子機(jī)制目前尚未明確。本研究旨在優(yōu)化重組人β-catenin(138～686 aa)在大腸埃希菌中的原核表達(dá)條件，經(jīng)分離純化后進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫抵抗中的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pET-30a(+)載體由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所林媛副研究員惠贈(zèng)；大腸埃希菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和E.coliRosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自General Biosystems公司；HeLa細(xì)胞由本室保存。

1.1.2 試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量、pEASY?-T1試劑盒、EasyPure?膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量、BamHⅠ、XhoⅠ購(gòu)自全式金公司；BCA(bicinchoninic acid)試劑盒購(gòu)自Thermo公司；氨芐西林、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、小鼠抗組氨酸(histidine, His)標(biāo)簽單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自Biosharp公司；HRP底物化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海天能科技有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)溶液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap層析柱購(gòu)自GE公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的Lef1 [FITC-Lef1: FITC-GDPELCATDEMIPFKDE]由杭州丹港生物科技有限公司合成；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)和GST-Lef1蛋白由本室制備；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器與設(shè)備 梯度PCR儀(C1000 TouchTM型,BIO-RAD公司)加熱制冷型金屬浴(H2O3-100C型，CYOTE BIOSCIENCE公司)；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-32B型，北京市六一儀器廠)；電泳儀電源(DYY-2C型，北京市六一儀器廠)；高速冷凍離心機(jī)(5804R型，eppendrof公司)；細(xì)菌震蕩培養(yǎng)箱(ZQLY-180N型，上海知楚儀器公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY92-ⅡN型，SCIENTZ公司)；AKTA Pure 25M(GE公司)；蛋白質(zhì)電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra型，BIO-RAD公司)；轉(zhuǎn)膜儀(Trans-Blot?TurboTM型，BIO-RAD公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(GenoSens 1800型，CLINX公司)；多功能酶標(biāo)儀(Cytation 5型，BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1β-catenin基因片段的擴(kuò)增 β-catenin核心結(jié)構(gòu)域即犰狳蛋白重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域(138～686 aa)，主要介導(dǎo)與Wnt信號(hào)通路中重要大分子蛋白的相互作用[4-5]。根據(jù)β-catenin(138～686 aa)基因序列(GenBank:X87838.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2，P1和P2引物中分別加入BamHⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn)(表1)。以HeLa cDNA為模板，按照參考文獻(xiàn)[13-14]所述的方法設(shè)置PCR程序，進(jìn)行β-catenin基因片段(1 647 bp)的特異擴(kuò)增。β-catenin基因片段的擴(kuò)增結(jié)果以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再以EasyPure?膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.2 β-catenin克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 利用pEASY?-T1試劑盒，將回收的β-catenin基因片段與T載體連接，按照參考文獻(xiàn)[13-14]所述的方法進(jìn)行β-catenin克隆質(zhì)粒的構(gòu)建。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒由General Biosystems公司進(jìn)行測(cè)序，再以DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.3 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照參考文獻(xiàn)[13-14]所述的方法進(jìn)行重組質(zhì)粒β-catenin-pET30a(+)的構(gòu)建。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒β-catenin-pET30a(+)轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，以單菌落PCR法初步經(jīng)卡那霉素抗性篩選的單菌落鑒定陽(yáng)性克隆后，再提取質(zhì)粒以雙酶切法進(jìn)行鑒定。

1.2.4 β-catenin原核表達(dá) 按照參考文獻(xiàn)[13-14]所述的方法進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)。將鑒定正確的重組質(zhì)粒β-catenin-pET30a(+)轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將7株經(jīng)卡那霉素抗性篩選的單菌落分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，以1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)6 h。離心收集菌體后，以8% SDS-PAGE檢測(cè)β-catenin原核表達(dá)。

1.2.5 β-catenin誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 將工程菌于37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.7時(shí)，加入1.0 mmol/L IPTG后誘導(dǎo)和繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)間點(diǎn)等量收集菌體，以SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析β-catenin表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為30、25 ℃，重復(fù)上述操作，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.6 β-catenin誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 等量收集37 ℃誘導(dǎo)6 h、30 ℃誘導(dǎo)8 h和25 ℃誘導(dǎo)10 h的工程菌菌體，將其重懸于適量的TBS(50 mmmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH 8.0)溶液中，以超聲波細(xì)胞破碎機(jī)裂解菌體。收集裂解后的上清液和沉淀，以SDS-PAGE鑒定β-catenin的可溶表達(dá)，確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.7 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將工程菌于37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.7時(shí)，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG后，25 ℃誘導(dǎo)10 h。等量收集菌體，以SDS-PAGE分析β-catenin表達(dá)量并確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.8 β-catenin分離純化與鑒定 工程菌經(jīng)大量培養(yǎng)后，收集菌體并裂解。裂解的上清液用25%飽和硫酸銨鹽析后制備粗提液，再按照參考文獻(xiàn)[13-14]所述的HisTrap親和層析方法和Western blot實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行β-catenin的分離純化與鑒定。純化的β-catenin以SDS-PAGE進(jìn)行純度分析。

1.2.9 熒光偏振實(shí)驗(yàn)(fluorescence polarization, FP) 參考文獻(xiàn)[13，15]，首先將80 nmol/L FITC-Lef1(30 μL/孔,3組復(fù)孔)加入到全黑384孔板中，然后再以30 μL/孔的量依次加入1 000、900、800、600、400、200、100、50、0 nmol/L的β-catenin，室溫孵育20 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)毫偏值(millipolarization unit, mP)，擬合結(jié)合曲線后計(jì)算解離常數(shù)Kd值。

1.2.10 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 按照參考文獻(xiàn)[14]所述的ELISA方法進(jìn)行β-catenin的生物學(xué)活性鑒定。包被GST與GST-Lef1(10 μg/mL,100 μL/孔)的96孔酶標(biāo)板經(jīng)10% BSA封閉后，各孔依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL β-catenin(100 μL/孔,3組復(fù)孔)，室溫反應(yīng)1 h。依次加入小鼠抗His標(biāo)簽單抗(1∶ 2 000)和HRP-羊抗小鼠IgG(1∶ 4 000)后，以TMB溶液顯色，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以HeLa cDNA為模板，特異性擴(kuò)增出約1 647 bp的基因片段，與β-catenin預(yù)期大小一致(圖1a)。隨機(jī)選取6株經(jīng)卡那霉素抗性篩選的單菌落進(jìn)行PCR反應(yīng)和質(zhì)粒雙酶切鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6株單菌落均可特異性擴(kuò)增出約1 647 bp的基因片段(圖1b)且重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可再次得到同樣大小的基因片段(圖1c)。PCR擴(kuò)增的β-catenin基因片段(QUERY)經(jīng)測(cè)序和BLAST比對(duì)分析后，與β-catenin預(yù)期基因序列(SUBJECT)的同源性為100%(圖1d)。上述結(jié)果表明，β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 The construction of prokaryotic expression plasmid for β-catenina:β-catenin基因片段的擴(kuò)增,1: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量, 2:β-catenin基因片段;b:單菌落PCR鑒定反應(yīng), 1: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量， 2～7: PCR擴(kuò)增的β-catenin基因片段;c： 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定，1: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量， 2: β-catenin基因片段； d： PCR擴(kuò)增的β-catenin基因片段BLAST分析 a：PCR product of β-catenin gene， 1: DNA Marker， 2: β-catenin gene;b： PCR products of six random positive clones， 1: DNA Marker， 2-7: β-catenin gene; c： Restriction enzyme digestion profile for β-catenin-pET-30a(+) plasmid， 1: DNA Marker， 2: β-catenin gene fragment； d： BLAST analysis map for β-catenin gene amplified by PCR

2.2 β-catenin的原核表達(dá)

SDS-PAGE分析表明，7株工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子量66 kDa左右顯現(xiàn)明顯的蛋白表達(dá)條帶，這與預(yù)期的β-catenin分子質(zhì)量基本一致(圖2)。上述結(jié)果表明，成功進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)。

圖2 β-catenin的原核表達(dá)Fig.2 Prokaryotic expression of β-catenin 1: 陰性對(duì)照; 2: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量; 3～9: 誘導(dǎo)的工程菌1: Negative control; 2: Protein Marker; 3-9: Positive clones

2.3 β-catenin誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

工程菌經(jīng)不同誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間培養(yǎng)后，等量菌體以SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析β-catenin原核表達(dá)量。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，β-catenin表達(dá)量在誘導(dǎo)6 h時(shí)趨于穩(wěn)定，最大表達(dá)量約為16.43%(圖3a、3b)；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，β-catenin表達(dá)量在誘導(dǎo)8 h時(shí)趨于穩(wěn)定，最大表達(dá)量約為17.83%(圖3c、3d)；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，β-catenin表達(dá)量在誘導(dǎo)10 h時(shí)趨于穩(wěn)定，最大表達(dá)量約為18.41%(圖3e、3f)。

圖3 β-catenin誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Determination of an optimal induction length for high yield of β-catenin a、c、e：β-catenin在37、30、25 ℃誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。1: 陰性對(duì)照; 2: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量; 3: 0 h; 4: 2 h; 5: 4 h; 6: 6 h; 7: 8 h; 8: 10 h; 9: 12 h。b、d、f：β-catenin在37、30、25 ℃各誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析a,c,e：SDS-PAGE profile of β-catenin expressed at 37, 30 and 25 ℃ for 0-12 h. 1: Negative control; 2: Protein Marker; 3: Total cell proteins (TCP), 0 h; 4: TCP, 2 h; 5: TCP, 4 h; 6: TCP, 6 h; 7: TCP, 8 h; 8: TCP, 10 h; 9: TCP, 12 h. b,d,f：Analysis of prokaryotic expression percentage of β-catenin expressed at 37, 30 and 25 ℃ for 0-12 h

2.4 β-catenin誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

工程菌分別于37 ℃誘導(dǎo)6 h、30 ℃誘導(dǎo)8 h和25 ℃誘導(dǎo)10 h后，裂解菌體，收集上清液和沉淀。SDS-PAGE分析表明，37 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)，β-catenin大部分以包涵體形式存在，上清液中β-catenin含量較少；30 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)，β-catenin包涵體表達(dá)量略有減少，上清液中β-catenin量略有增多；25 ℃誘導(dǎo)10 h時(shí)，β-catenin包涵體表達(dá)量最少，上清液中β-catenin量最多，β-catenin以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)(圖4)。

圖4 β-catenin誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化Fig.4 Determination of an optimal induction temperature for high yield of β-catenin 1: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量; 2: 全菌蛋白(37 ℃); 3: 上清液(37 ℃); 4: 沉淀(37 ℃); 5: 全菌蛋白(30 ℃); 6:上清液(30 ℃); 7: 沉淀(30 ℃); 8: 全菌蛋白(25 ℃); 9: 上清液(25 ℃); 10: 沉淀(25 ℃)1: Protein Marker; 2: TCP (37 ℃); 3: Supernatant (37 ℃); 4: Pellet (37 ℃); 5: TCP (30 ℃); 6: Supernatant (30 ℃); 7: Pellet (30 ℃); 8: TCP (25 ℃); 9: Supernatant (25 ℃); 10: Pellet (25 ℃)

2.5 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

工程菌以不同濃度的IPTG于25 ℃誘導(dǎo)10 h，收集等量菌體，以SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析β-catenin表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)條件下，β-catenin表達(dá)量基本相同，確定0.2 mmol/L IPTG作為最佳誘導(dǎo)濃度(圖5a、5b)。

綜上所述，確定誘導(dǎo)溫度25 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間10 h、0.2 mmol/L IPTG作為β-catenin最佳原核表達(dá)條件。

2.6 β-catenin分離純化與鑒定

以25%飽和硫酸銨溶液沉淀菌體裂解上清液，制備β-catenin粗提液，再以HisTrap層析柱分離純化。SDS-PAGE分析表明，純化的β-catenin具有較高的純度，樣品均呈單一條帶且與預(yù)期分子量(66 kDa)一致(圖6a)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，在預(yù)期分子量位置仍可顯現(xiàn)特異條帶，證實(shí)了β-catenin的正確表達(dá)(圖6b)。純化的β-catenin以BCA法定量，其濃度為1.0 mg/mL。

圖5 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化Fig.5 Determination of an optimal IPTG concentration for high yield of β-catenina：IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化，1: 陰性對(duì)照， 2: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量, 3: 0 mmol/L IPTG， 4: 0.2 mmol/L IPTG， 5: 0.4 mmol/L IPTG， 6: 0.6 mmol/L IPTG， 7: 0.8 mmol/L IPTG， 8： 1.0 mmol/L IPTG;b：在不同IPTG誘導(dǎo)濃度條件下β-catenin表達(dá)量的定量分析a：SDS-PAGE profile of β-catenin expressed in different IPTG concentrations at 25 ℃ for 10 h，1: Negative control，2: Protein Marker; 3: 0 mmol/L IPTG， 4: 0.2 mmol/L IPTG， 5: 0.4 mmol/L IPTG， 6: 0.6 mmol/L IPTG， 7: 0.8 mmol/L IPTG， 8: 1.0 mmol/L IPTG; b：Analysis of prokaryotic expression percentage of β-catenin expressed in different IPTG concentrations at 25 ℃ for 10 h

2.7 β-catenin生物學(xué)活性鑒定

腫瘤細(xì)胞內(nèi)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要通過(guò)β-catenin/Lef1相互作用形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，進(jìn)而啟動(dòng)大量原癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[1，16]。根據(jù)β-catenin/Lef1相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息，將FITC-Lef1作為β-catenin結(jié)合蛋白的模擬物[17]，以熒光偏振實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin與FITC-Lef1的特異性結(jié)合反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，β-catenin/FITC-Lef1相互作用具有明顯的量效關(guān)系，結(jié)合反應(yīng)解離常數(shù)Kd值為55 nmol/L(圖7a)。以GST-Lef1作為β-catenin結(jié)合蛋白，ELISA實(shí)驗(yàn)表明，β-catenin與GST-Lef1的結(jié)合反應(yīng)也具有良好的濃度依賴性(圖7b)。上述結(jié)果表明，純化的β-catenin能與FITC-Lef1和GST-Lef1發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明純化的β-catenin具有良好的生物學(xué)活性。

圖6 β-catenin的分離純化與鑒定Fig.6 Purification and identification of β-catenina：β-catenin的分離純化， 1: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量， 2: 25%飽和硫酸銨粗提液，3～4: 純化的β-catenin;b： Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定β-catenin， 1: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量， 2: β-catenin條帶(66 kDa)a： Purification of β-catenin by HisTrap， 1: Protein Maker， 2: Precipitated β-catenin by 25% saturated ammonium sulfate solution， 3-4: Purified β-catenin (66 kDa)；b：Identification of purified β-catenin by Western blot analysis， 1: Protein Marker， 2: β-catenin band (66 kDa)

圖7 β-catenin生物學(xué)活性鑒定Fig.7 Biological activity identification of purified β-catenina：熒光偏振實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin與FITC-Lef1的結(jié)合反應(yīng); b：ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin與GST-Lef1的結(jié)合反應(yīng)a：Analysis of specific binding between β-catenin and FITC-Lef1 using fluorescence polarization assay; b：Analysis of specific binding between β-catenin and GST-Lef1 using ELISA assay

3 討 論

大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、成本廉價(jià)等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為重組蛋白制備的首選表達(dá)方案[18]。由于外源蛋白融合分子量較小的His標(biāo)簽后，極大地方便了重組蛋白的純化與檢測(cè)[19]。故本研究在β-catenin基因片段的N端和C端融合了pET-30a(+)載體的His標(biāo)簽，成功進(jìn)行了β-catenin核心結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)與活性鑒定。建立的β-catenin原核表達(dá)方法與已報(bào)道的GST-β-catenin-His雙標(biāo)簽融合表達(dá)策略相比[20-21]，具有良好的簡(jiǎn)便性，不但無(wú)需繁瑣的GST標(biāo)簽酶切和再純化操作，經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化后β-catenin還具有更高的產(chǎn)量和生物學(xué)活性。

原核表達(dá)優(yōu)化的主要目的是在低成本的實(shí)驗(yàn)室條件下，盡可能提高外源蛋白產(chǎn)量。鑒于誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度與IPTG誘導(dǎo)濃度是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素[22-24]，進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度是影響β-catenin原核表達(dá)的重要參數(shù)。37 ℃和30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，β-catenin在上清液中含量較少，易于形成包涵體，這可能與高溫導(dǎo)致目的蛋白快速表達(dá)而無(wú)法正確折疊有關(guān)；25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，β-catenin包涵體含量明顯減少，大部分以可溶形式表達(dá)，這可能與低溫促進(jìn)目的蛋白的正確折疊和增加可溶性有關(guān)[22]。大腸埃希菌在低溫培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)緩慢，一般通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間以增加目的蛋白的表達(dá)量。工程菌在25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，β-catenin表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)而逐漸升高，在誘導(dǎo)10 h左右，基本達(dá)到表達(dá)量高峰，故確定25 ℃誘導(dǎo)10 h作為β-catenin最佳表達(dá)條件。另外，IPTG對(duì)β-catenin原核表達(dá)的誘導(dǎo)效率很高，0.2 mmol/L IPTG即可達(dá)到良好的誘導(dǎo)效果。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路，該信號(hào)通路的高度活化主要基于β-catenin/Lef1相互作用形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，進(jìn)而啟動(dòng)大量原癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[1，16]。因此，β-catenin與Lef1的體外高親和力相互作用是評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性的核心指標(biāo)之一。熒光偏振技術(shù)主要基于偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)的原理，被廣泛應(yīng)用于藥物高通量篩選、生物大分子活性分析及疾病診斷[13，15，25-28]。只有當(dāng)分子量較大的β-catenin和分子量較小FITC-Lef1發(fā)生高特異性結(jié)合反應(yīng)時(shí)，由于復(fù)合物的分子量將增大，激發(fā)時(shí)分子旋轉(zhuǎn)速度較慢，熒光偏振檢測(cè)則表現(xiàn)較高的mP值；如果未有特異性結(jié)合反應(yīng)的發(fā)生，由于FITC-Lef1的分子量較小，激發(fā)時(shí)分子旋轉(zhuǎn)速度較快，那么發(fā)射光將發(fā)生去偏振化，熒光偏振檢測(cè)則表現(xiàn)較低的mP值。在熒光偏振實(shí)驗(yàn)中，將FITC-Lef1作為β-catenin結(jié)合蛋白的模擬物[17]，在溶液環(huán)境中檢測(cè)β-catenin與FITC-Lef1的特異性結(jié)合反應(yīng)，真實(shí)地反應(yīng)了生命環(huán)境中β-catenin與Lef1相互作用的親和力(Kd=55 nmol/L)。但FITC-Lef1作為一條短肽，還不足以完全模擬生物大分子Lef1的真實(shí)理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)。故利用包被GST-Lef1的ELISA實(shí)驗(yàn)，在固相環(huán)境中再次確證了β-catenin能與GST-Lef1蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，純化的β-catenin具有良好的生物學(xué)活性。

本研究成功進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)條件的優(yōu)化與生物學(xué)活性鑒定，為進(jìn)一步研究β-catenin在腫瘤免疫抵抗中的生物學(xué)功能提供了參考。

致謝衷心感謝中國(guó)科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院十一所生物技術(shù)應(yīng)用研究室副主任岳玉環(huán)研究員和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李霓副研究員在β-catenin原核表達(dá)和活性鑒定方面給予的悉心指導(dǎo)和無(wú)私幫助！