李 偉,張小英,陳 熔,苗建銀,陳運(yùn)嬌,曹 庸

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

月見(jiàn)草素B(Oenothein B,OEB,圖1)最初是從月見(jiàn)草屬植物中分離出來(lái)的一種大環(huán)二聚體鞣花鞣質(zhì);現(xiàn)代研究指出桃金娘屬、千屈菜屬、柳葉菜屬等植物中均可分離出OEB[1-3](表1)。這些屬許多植物(百千層、香桃木、藍(lán)桉等)傳統(tǒng)上常用于各種醫(yī)療目的,如前列腺和腸胃疾病、傷口愈合和皮膚應(yīng)激[4];經(jīng)過(guò)大量體外和體內(nèi)研究表明,OEB是這些植物提取物中存在的主要生物活性成分之一[5-7]。作為大環(huán)二聚體單寧,OEB屬于水解單寧,其分子結(jié)構(gòu)中有大量酯鍵和糖苷鍵,而二聚體結(jié)構(gòu)和葡萄糖上沒(méi)食子酰基為增強(qiáng)其生物活性所必需。已有研究指出OEB具備良好的抗腫瘤[8-9]、抗炎[10-11]及抗氧化[12-13]等生物活性,具有重要研究意義。但OEB規(guī)模化分離純化困難,國(guó)內(nèi)商業(yè)化產(chǎn)品價(jià)格昂貴;同時(shí),特殊的多羥基結(jié)構(gòu)造成其易被氧化,體內(nèi)外穩(wěn)定性較差。目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于OEB的研究論文較少,國(guó)外研究論文較多。結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),本文旨在綜述OEB的結(jié)構(gòu)特性、理化性質(zhì)及生物活性研究進(jìn)展,以期為OEB深入研究提供研究思路。

圖1 月見(jiàn)草素B結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of oenothein B

表1 OEB在植物中的分布Table 1 Distribution of oenothein B in plants

OEB被分離出來(lái)后是一種無(wú)定型的粉末,質(zhì)譜結(jié)果表明其質(zhì)荷比(m/z)為1569[M+H]+,分子式為C68H48O44。OEB結(jié)構(gòu)上含有兩個(gè)未?；咸烟悄负?理論上可以形成四種難以分離的混合物,這也給后續(xù)光譜分析造成干擾。常溫條件下氫譜信息中質(zhì)子信號(hào)拓寬和倍增也是這類(lèi)大環(huán)寡聚物的特征之一,這是由于葡萄糖母核上發(fā)生異構(gòu)化導(dǎo)致。然而,在40～50 ℃條件下氫譜數(shù)據(jù)表明,在δ6.20(d,J=3.5 Hz)和δ4.48(d,J=7.5 Hz)處的特征信號(hào)分別是α-葡萄糖和β-葡萄糖[2]。NaBH4降解表明芳香區(qū)有6個(gè)1H單峰態(tài)和2個(gè)2H單峰態(tài),證明兩個(gè)葡糖糖母核上均有纈氨?；](méi)食子?；捌咸烟谴蓟鶊F(tuán),而基團(tuán)之間的結(jié)合模式由1H-13C位移相關(guān)光譜和在OEB處理后獲得的部分水解產(chǎn)物鑒定得出[25]。最終確定OEB結(jié)構(gòu)上是以?xún)蓚€(gè)特里馬素Ⅰ單元構(gòu)成,其中以葡萄糖(α-葡萄糖和β-葡萄糖)為母核,結(jié)合沒(méi)食子?；怎ユI和糖苷鍵的形式形成大環(huán)二聚體鞣花單寧[26]。

OEB是一種大環(huán)二聚體單寧,分子式C68H48O44,其常溫下呈白色或者淡黃色粉末狀[2]。OEB易溶于水、乙醇等極性溶劑,而在乙酸乙酯和石油醚等低極性溶劑中基本不溶。同時(shí),OEB在高溫(>80 ℃)、堿性pH(>7)以及消化系統(tǒng)水解酶(胰蛋白酶、脂肪酶)等條件下不穩(wěn)定,容易發(fā)生水解,分解成酚酸類(lèi)和多元醇等,造成功能活性降低[27]。曹素芳等[28]研究指出小鼠體內(nèi)的代謝實(shí)驗(yàn)也表明OEB在體內(nèi)代謝不穩(wěn)定,在胃腸道中已經(jīng)發(fā)生降解,生物利用率低。基于OEB相對(duì)分子量大、體內(nèi)不穩(wěn)定等特征,現(xiàn)代研究指出可采用納米乳液[29]、微乳[30]以及脂質(zhì)體[31]等穩(wěn)態(tài)化技術(shù)進(jìn)行包埋,以期提高OEB的穩(wěn)定性。

2 月見(jiàn)草素B的生物活性

2.1 抗腫瘤

作為二聚體水解單寧的OEB,獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予其良好的抗腫瘤活性。在已有的研究中,OEB除了對(duì)腫瘤細(xì)胞造成直接殺傷力和抑制/促進(jìn)相關(guān)酶系活力之外,主要以宿主介導(dǎo)的抗腫瘤活性為主。圍繞OEB與機(jī)體自身免疫對(duì)腫瘤的協(xié)同作用進(jìn)行研究,以期探究OEB抗腫瘤作用機(jī)制，將OEB注射到小鼠腹腔中誘導(dǎo)腹腔中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腹膜滲出物,引起IL-1釋放,結(jié)果表明OEB通過(guò)激活巨噬細(xì)胞分泌、增強(qiáng)宿主免疫,以達(dá)到抑制小鼠體內(nèi)Meth·A型腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的作用[32]。這提示OEB等單寧類(lèi)物質(zhì)可能通過(guò)增強(qiáng)宿主細(xì)胞免疫活性進(jìn)而達(dá)到抗癌的作用。相似研究指出二聚體馬桑鞣素A和月見(jiàn)草素A同樣能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫以達(dá)到宿主介導(dǎo)的抗腫瘤活性[33]。在MM2腹水腫瘤細(xì)胞模型中,提前4 d在小鼠腹腔接種S-180細(xì)胞,將45種鞣花酸類(lèi)物質(zhì)注射進(jìn)小鼠體內(nèi),以小鼠壽命增加70%及以上作為評(píng)價(jià)抗癌效果指標(biāo),結(jié)果表明二聚體鞣花酸中OEB具有突出的抗癌活性;單寧單元體和二聚體單寧(OEB)表現(xiàn)出優(yōu)越抗癌作用,這與結(jié)構(gòu)中葡萄糖母核上2和3位置的沒(méi)食子?；嘘P(guān)[34]。此外,從細(xì)葉萼距花中分離出四種二聚體單寧,并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行研究。其中OEB能顯著抑制人體腫瘤細(xì)胞KB、Hela、Hep3B和HL-60等的生長(zhǎng),而對(duì)正常細(xì)胞的毒性更低,甚至低于抗腫瘤物質(zhì)阿霉素;此外,還研究了OEB對(duì)S-180細(xì)胞和含有S-180瘤細(xì)胞的ICR小鼠的作用效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)中月見(jiàn)草素B對(duì)S-180細(xì)胞表現(xiàn)出很大細(xì)胞毒性(IC50=11.4 μg/mL),同時(shí)能顯著提高接種S-180腫瘤細(xì)胞小鼠的存活率,表明OEB通過(guò)抑制S-180細(xì)胞活性起到抗腫瘤效果[35]。此外,上述研究提示OEB等二聚體單寧類(lèi)物質(zhì)的抗癌作用不是簡(jiǎn)單的細(xì)胞毒性作用,推測(cè)其通過(guò)改善宿主自身免疫調(diào)節(jié)功能從而達(dá)到最佳的抗腫瘤活性。

Vitalone等[36]發(fā)現(xiàn)柳葉菜屬植物來(lái)源的OEB能抑制PZ-HPV-7、LNCaP、HMEC、1321N1四種細(xì)胞系的DNA合成,阻止前列腺細(xì)胞增殖;通過(guò)比較Epilobiumangustifolium和Epilobiumspicatum兩種來(lái)源提取物抑制DNA合成的能力和OEB含量,研究發(fā)現(xiàn)前者提取物中OEB含量高于相同物種近40倍,抑制人體前列腺細(xì)胞系中DNA合成作用明顯,推測(cè)OEB以非特異性的方式在抑制前列腺細(xì)胞的增殖中起作用。有研究指出這種抑制作用不是細(xì)胞毒性作用引起的,而是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的干擾實(shí)現(xiàn)的[37]。同時(shí),這也與OEB抑制前列腺增生進(jìn)程中5α-還原酶和芳香化酶有關(guān)[38]。由于抑制前列腺細(xì)胞增殖被認(rèn)為在治療前列腺增生和肥大中是有用的,而這與前列腺炎癥的發(fā)生相關(guān)。前列腺慢性炎癥可能通過(guò)氧化應(yīng)激或誘導(dǎo)誘變產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生或腫瘤[39]。這提示OEB抑制前列腺細(xì)胞增生,在一定程度上能間接性緩解細(xì)胞炎癥、降低腫瘤發(fā)生率。此外,相似研究指出OEB能抑制EBV病毒中DNA聚合酶的數(shù)量從而達(dá)到抑制腫瘤的作用[40]。有報(bào)道前列腺增生人體體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活力和血管緊張素Ⅱ含量顯著高于正常人,這提示腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的激活可能參與前列腺增生的病理生理過(guò)程。而同屬鋅金屬肽酶的中性?xún)?nèi)肽酶能催化多種活性肽降解以改善前列腺增生的情況,甚至有研究認(rèn)為中性?xún)?nèi)肽酶的變化與前列腺癌密切相關(guān)。通過(guò)PC-3細(xì)胞前列腺癌模型得出柳葉菜屬水提取及從中分離的OEB統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著提高中性?xún)?nèi)肽酶的活性,一定程度上有利于減緩前列腺增生,這與其抑制細(xì)胞內(nèi)5α-還原酶相關(guān)酶類(lèi)有關(guān),為民間藥物提供了藥理方面的解釋[41]。

2.2 抗炎作用

炎癥是機(jī)體受到外界刺激而引起的一系列生理生化變化的病理過(guò)程。臨床上非甾體類(lèi)抗炎藥、甾體類(lèi)抗炎藥及中藥常被用來(lái)阻斷炎癥反應(yīng)。化學(xué)合成抗炎藥物使用過(guò)程中機(jī)體逐漸產(chǎn)生的抗藥性及毒副作用,而天然產(chǎn)物中抗炎活性成分因毒副作用小、效果顯著等特點(diǎn)受到研究人員的青睞[42]。研究報(bào)道指出OEB具有良好的抗炎作用,能有效降低LPS和TLR4誘導(dǎo)的NO含量、iNOS基因及蛋白的表達(dá)水平,這與它減少了NF-κβ(p50)亞基與生物素化的共有序列的結(jié)合并降低了NF-κβ(p65)易位有關(guān);同時(shí)OEB能有效抑制炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子、白介素-6)分泌[11]。相似研究發(fā)現(xiàn)OEB能顯著抑制NF-κβ活性,降低因激活NF-κβ引起的iNOS基因過(guò)度表達(dá),達(dá)到緩解炎癥的作用[10]。此外,OEB有效抑制嗜中性粒細(xì)胞中髓過(guò)氧化物酶(MPO)產(chǎn)生,這與OEB能抑制脂肪氧合酶活性有關(guān);同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)OEB作為一種有效COX-1抑制劑,能有效地緩解炎癥,起到類(lèi)似于抗炎藥吲哚美辛的作用[6]。這表明OEB在體外細(xì)胞模型中能有效降低刺激物導(dǎo)致的細(xì)胞炎癥現(xiàn)象,為開(kāi)展體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)提供基本的研究數(shù)據(jù)。有報(bào)道以脂多糖注射到ICR小鼠腹膜進(jìn)行造模,研究小鼠口服OEB對(duì)全身炎癥引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響。結(jié)果表明口服OEB組小鼠顯著抑制曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中LPS誘導(dǎo)造成的小鼠異常行為、海馬和紋狀體中小膠質(zhì)細(xì)胞活化和COX-2的產(chǎn)生;在系統(tǒng)性炎癥過(guò)程中,OEB具有緩解腦中神經(jīng)炎癥的能力[43]。OEB相對(duì)分子量為1569,在體內(nèi)很難被直接吸收利用起到抗炎作用。有研究指出鞣花單寧容易被腸道菌群代謝成更小的代謝物,這些代謝物對(duì)結(jié)腸成纖維細(xì)胞有抗炎作用[44-45]。這些發(fā)現(xiàn)也表明OEB可能在體內(nèi)與腸道菌群發(fā)生作用,生成更小的代謝物,再起到抗炎作用。綜上,OEB在體內(nèi)外均有良好的抗炎活性,但其在體內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物仍需深入研究,尤其是抗炎代謝組分。

2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫作用是機(jī)體實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)的重要方式,適度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要。激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子及提高免疫球蛋白等途徑都能有效提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)OEB顯著下調(diào)人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)細(xì)胞表面上CD1a和CD83的表達(dá),抑制DC的分化和成熟,對(duì)機(jī)體起到免疫調(diào)節(jié)作用;這種抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān),細(xì)胞有明顯核縮合的形態(tài)特征支持了上述觀點(diǎn)[46]。目前,研究表明OEB通過(guò)下調(diào)細(xì)胞因子、誘導(dǎo)DC功能障礙以及細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮外周免疫調(diào)節(jié)作用,這些研究一定程度上揭示含鞣質(zhì)的藥用植物用于治療各種炎性疾病的傳統(tǒng)用途。OEB等多酚類(lèi)化合物不僅通過(guò)傳統(tǒng)的抗氧化作用起到對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用,它還能調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)引起機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。例如,研究指出OEB能發(fā)揮抗腫瘤作用,但這一定程度上是通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體白介素-1β含量上升促進(jìn)宿主免疫調(diào)節(jié)作用而實(shí)現(xiàn)的。Schepetkin等[47]發(fā)現(xiàn)柳葉菜屬提取物中OEB是引起中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的主要成分,OEB被注入到小鼠腹腔后引發(fā)原發(fā)性嗜中性粒細(xì)胞趨化劑IL-8和嗜中性粒細(xì)胞在小鼠腹膜聚集從而起到免疫調(diào)節(jié)作用;此外,OEB在體外誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞發(fā)揮功能,包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+通量、活性氧的產(chǎn)生、趨化性、NF-κβ活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。Ramstead等[48]指出OEB能刺激牛和人淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞和NK細(xì)胞),誘導(dǎo)細(xì)胞表面抗體表達(dá)(CD25或CD69);還發(fā)現(xiàn)了OEB能單獨(dú)或與白介素-18(IL-18)共同作用以促進(jìn)牛和人的NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-c(IFNc)。干擾素有助于提高機(jī)體抗腫瘤、抗菌及抗病毒作用,這也部分解釋了OEB增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用機(jī)制。另外,OEB作為一種相對(duì)分子量較大的鞣花單寧,常規(guī)情況下其難以被直接吸收起到免疫調(diào)節(jié)作用。有研究指出以O(shè)EB分子式上的子結(jié)構(gòu)物質(zhì)為參比對(duì)象(沒(méi)食子酸、鄰苯二酚、鄰苯三酚、3,4-二羥基苯甲酸等),發(fā)現(xiàn)OEB完整結(jié)構(gòu)在體內(nèi)外才具有更強(qiáng)調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬功能的作用。這也說(shuō)明OEB很有可能不是直接調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能,而是以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生自身免疫的方式。此外,OEB在體內(nèi)被腸道微生物代謝成其他的功能小分子,也有可能是促進(jìn)機(jī)體免疫的重要原因之一。

2.4 抗氧化

目前,單寧類(lèi)物質(zhì)已被證實(shí)具有明確的抗氧化、抗衰老等作用[49-53]。OEB結(jié)構(gòu)上22個(gè)酚羥基有助于增強(qiáng)其抗氧化活性,達(dá)到淬滅O2-和DPPH自由基的作用,其IC50分別為0.9和6.1 μmoL/L[54]。從桃金娘科桉樹(shù)葉中分離出十種酚類(lèi)化合物,其中OEB能有效的清除DPPH自由基(EC50=6.12 μmoL/L),起到抗氧化作用[55]。Amakura等[14]研究指出桉葉提取物在DPPH和ORAC體外抗氧化評(píng)價(jià)中表現(xiàn)良好的抗氧化活性,通過(guò)HPLC液相色譜分析得出主峰包括沒(méi)食子酸、鞣花酸及OEB等物質(zhì);同時(shí)基于抗氧化活性、液相色譜分離度及相對(duì)穩(wěn)定性,提出OEB可作為桉樹(shù)葉提取物標(biāo)志成分之一。OEB和鞣花酸是多酚化合物,其氧化機(jī)理是pH依賴(lài)性的,涉及不同數(shù)量的電子和質(zhì)子。OEB除了具有明確的抗氧化能力外,在延緩衰老方面也有不少研究。陳運(yùn)嬌[56]發(fā)現(xiàn)OEB處理野生型秀麗線(xiàn)蟲(chóng)后平均壽命延長(zhǎng)22%,線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),并能降低后期老年斑含量。根據(jù)自由基理論,推測(cè)OEB通過(guò)阻斷自由基反應(yīng)、清除過(guò)剩自由基,直接或者間接地通過(guò)增強(qiáng)抗氧化性而起到延緩衰老的作用[57]。

2.5 其它作用

OEB除了上述抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用,還有抗真菌等作用。有研究表明從扁櫻桃中分離得到的OEB具有有效的抗真菌作用,它能干擾巴西副球孢子菌形態(tài),表現(xiàn)在細(xì)胞表面粗糙和細(xì)胞壁破裂。它抑制了參與細(xì)胞壁的1,3-β-D-葡聚糖合酶(PbFKS1)基因的轉(zhuǎn)錄,干擾了巴西副球孢子菌的細(xì)胞形態(tài)[58]。為了闡明候選化合物OEB的作用模式,通過(guò)代表性差異分析(RDA)進(jìn)一步分析OEB處理巴西副球孢子菌后基因的變化,發(fā)現(xiàn)OEB調(diào)控合成細(xì)胞壁的關(guān)鍵基因(GLN1、KRE6、FKS1);此外,OEB還參與涉及維持細(xì)胞膜形態(tài)和壓力等細(xì)胞過(guò)程[59]。這些結(jié)果都表明OEB能起到有效的抗真菌作用,主要通過(guò)參與細(xì)胞壁合成的相關(guān)途徑起作用,為其他植物化合物抗真菌作用機(jī)制提供一定的借鑒。此外,許多單寧酸及相關(guān)的多酚類(lèi)化合物對(duì)直接作用的誘變劑均具有抗誘變活性,這表明這些化合物可潛在地對(duì)抗氧介導(dǎo)的DNA損傷,也有研究報(bào)道OEB具有類(lèi)似的作用。Silva等以SOS-Inductest和體內(nèi)小鼠骨髓微核(MN)為模型,表明OEB沒(méi)有任何遺傳毒性,再用兩種試驗(yàn)聯(lián)合使用絲裂霉素C來(lái)評(píng)估OEB的抗原毒性和抗細(xì)胞毒性活性,它表現(xiàn)出對(duì)由絲裂霉素C誘導(dǎo)的原代DNA損傷的體內(nèi)保護(hù)活性[60]。另有研究發(fā)現(xiàn)OEB具有抗病毒作用,能有效抑制巴爾病毒(EBV)DNA聚合酶,從而達(dá)到抑制EBV復(fù)制的效果[40]。天然植物來(lái)源的OEB在體內(nèi)外具有多種生物活性,其優(yōu)異的抗菌、抗誘變及抗病毒活性是進(jìn)一步研究利用的基礎(chǔ),但現(xiàn)階段需要更深入的研究其作用機(jī)制。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

作為大環(huán)二聚體鞣花單寧,月見(jiàn)草素B具有良好的生物活性,自發(fā)現(xiàn)以來(lái)其在抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面展現(xiàn)顯著效果,研究與應(yīng)用前景十分廣闊。從生物活性的角度來(lái)看,OEB早期研究主要體現(xiàn)在其抗腫瘤作用,受限于技術(shù)的發(fā)展研究層次不高,且抗腫瘤的作用機(jī)理不明確,往后的研究可依托于現(xiàn)代先進(jìn)的分子技術(shù),從基因、蛋白質(zhì)的層面深入考察OEB的作用機(jī)理。同時(shí),OEB在抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面研究相對(duì)較少,仍然需要大量的基礎(chǔ)研究。另,高分子量的物質(zhì)常因?yàn)槿芙舛群头€(wěn)定性等原因造成生物利用度比較低,故OEB的高分子量與其高生物活性之間的關(guān)系需要謹(jǐn)慎解釋。總體而言,OEB作為一種高分子量的大環(huán)二聚體鞣花酸,高效的生物活性使其具有重要的研究及應(yīng)用價(jià)值。