馬 超 張 韜 林潤(rùn)臺(tái) 周 煉 余立江 安普根 李依洲 趙繼志

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)OSCC 的治療取得了很多的創(chuàng)新和改革，但患者的 5年生存率仍不超 60%[2]。腫瘤干細(xì)胞理論研究發(fā)現(xiàn)，OSCC 中存在腫瘤干細(xì)胞，治療后仍頑固存在的腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一[3]。

ENPP1 （外核苷酸焦磷酸酶 / 磷酸二酯酶 1）是具有焦磷酸酶和磷酸二酯酶 活 性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在骨骼和軟骨中高表達(dá)。ENPP1 通過(guò)水解焦磷酸鍵和磷酸二酯鍵，生成核苷 5'- 單磷酸酯，在多種生理活動(dòng)中起調(diào)節(jié)作用，包 括核苷酸再循環(huán)以及ATP 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等[4，5]。最近的研究表明，ENPP1上調(diào)了干細(xì)胞標(biāo)志物 ABCG2，增加了腫瘤遷移能力并對(duì)乳腺癌的常規(guī)化學(xué)療法產(chǎn)生抗藥性[6]。抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的 ENPP1 會(huì)下調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，從而誘導(dǎo)腫瘤分化，凋亡以及增加對(duì)化學(xué)治療的敏感性[7]。肺癌組織中亦檢測(cè)到 ENPP1 的高表達(dá)，并且證實(shí)其高表達(dá)激活了腫瘤干細(xì)胞特性并參與了腫瘤細(xì)胞 EMT 的發(fā)生[8]。已有研究顯示，EMT在獲得癌癥干細(xì)胞表型的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[9]。但 ENPP1 是否在誘導(dǎo) OSCC 細(xì)胞干性和轉(zhuǎn)移中起調(diào)節(jié)作用仍不清楚。

本研究的目的在于探究ENPP1在OSCC患者腫瘤組織和OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)及其調(diào)控 OSCC細(xì)胞干性和轉(zhuǎn)移的重要作用。

資料和方法

1.臨床樣本：選取北京協(xié)和醫(yī)院口腔頜面外科2017 年至 2019 年收集資料完整的OSCC患者16例，所有患者均未行術(shù)前放化療。術(shù)中留取腫瘤原發(fā)灶和癌旁正常黏膜組織（對(duì)照）樣本。相關(guān)的組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理科鑒定，并經(jīng)過(guò)患者知情同意及倫理委員會(huì)許可。

2.主要試劑：試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco 公司，美國(guó)）；總蛋白提取試劑盒和細(xì)胞裂解液（上海碧云天公司）；ENPP1 shRNA （上海銳博生物）；抗 GAPDH 抗體（sc-365062）和抗 β-actin 抗體（sc-365062）購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；抗 ABCG2 （#42078），抗 Sox2（#4900），抗 NAOAG（#4893），抗 E-cadherin（#3195）和抗 Vimentin（#5741）抗體購(gòu)自美國(guó) CST 公司。

3.細(xì)胞 培養(yǎng)：人口腔鱗癌細(xì)胞系 Tca-8113、CAL-27 和 SCC-9 和正常人口腔粘膜細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入 5% CO2。

4.免疫組織化學(xué)染色：ENPP1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行[8]，運(yùn)用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行圖像信息分析，根據(jù)染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例綜合評(píng)分。按照染色輕重分類(lèi)：無(wú)染為 0分，輕度棕色 1 分，中度棕色 2 分，重度棕色3分；按照染色范圍分類(lèi)：染色區(qū)域＜5%為0分，5%~25%為 1 分，25%~75%為 2 分，≥75%為 3 分。IHC 綜合評(píng)分為上述兩個(gè)評(píng)分的總和。0~2 分為陰性，3~6 分為陽(yáng)性。

5.shRNA 轉(zhuǎn)染沉默 ENPP1 的表達(dá)：轉(zhuǎn)染前 24h用 1ml RPMI1640 全培養(yǎng)基將 CAL-27 細(xì)胞接種在6 孔板上，待細(xì)胞匯合度達(dá)到 70%~90%時(shí)，更換培養(yǎng)基。shRNA 的轉(zhuǎn)染濃度為 60pmol/ml，設(shè)立兩個(gè)ENPP1 轉(zhuǎn)染組（shENPP1-#1，shENPP1-#2）和 空 載對(duì)照組（shRNA-NC），培養(yǎng) 24h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

6.免疫印跡：按照文獻(xiàn)所述的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)[7]。蛋白印跡結(jié)果通過(guò) Syngene Imaging System 進(jìn)行成像，通過(guò) Image J 軟件對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

7.免疫熒光：將 CAL-27-NS 和 CAL-27-shENPP1細(xì)胞分別接種到6孔板的蓋玻片上，將細(xì)胞用TGF-β（5μM/ml）處理2天。如先前所述[8]進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

8.細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：在6孔板中培養(yǎng)CAL-27-NS和CAL-27-shENPP1 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞完全鋪展時(shí)，用200μl 移液器吸頭刮擦細(xì)胞。相同實(shí)驗(yàn)組通過(guò) TGF-β（5μM/ml）處理 2 天，捕獲圖片，檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

9.統(tǒng)計(jì)方法：采用 Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，采用非配對(duì)雙邊 t 檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

結(jié)果顯示，與正?？谇火つそM織相比，ENPP1在 8 個(gè) OSCC 組織中有 6 個(gè)顯著上調(diào) （如紅色圓形框所示）（圖 1A 和 B）。為進(jìn)一步分析，筆者通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢查了 16 對(duì) OSCC 組織中 ENPP1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正?？谇火つそM織（N）相比，腫瘤組織（T）中其染色強(qiáng)度和染色范圍顯著增加（圖 1C 和 D）。結(jié)果證實(shí) ENPP1 高表達(dá)與 OSCC的發(fā)展密切相關(guān)。

ENPP1 在正常人口腔粘膜細(xì)胞系中表達(dá)較低，其在人 OSCC 細(xì)胞株（CAL-27 和 Tca-8113）中表達(dá)顯著升高（圖 2A）。為確定 ENPP1 在 OSCC 中的作用，我們使用 CAL-27 細(xì)胞建立 ENPP1 敲低細(xì)胞系（shENPP1-#1 和 shENPP1-#2），發(fā)現(xiàn) shENPP1-#1敲低效果最佳（圖 2B）。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，與親代細(xì)胞CAL-27（NS）相比，shENPP1-#1 細(xì)胞中的 CSC 標(biāo)記NANOG、ABCG2、SOX2 和 CD44 顯著降低（圖 2C），證實(shí) OSCC 細(xì)胞中上調(diào)的 ENPP1 對(duì)于維持腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞表型至關(guān)重要。

研究顯示EMT可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的干性特征[9]。筆者發(fā)現(xiàn) TGF-β 處理 CAL-27 細(xì)胞后，EMT標(biāo)志物 vimentin 顯著增加，同時(shí)降低 E-cadherin 的表達(dá)。但在 CAL27-shENPP1 細(xì)胞中，TGF-β 誘導(dǎo)EMT 的作用顯著降低（圖 3A，3B）。結(jié)果證實(shí)，下調(diào)ENPP1 能夠抑制 OSCC 細(xì)胞 EMT 轉(zhuǎn)化。

圖1 ENPP1 在 OSCC 組織中表達(dá)升高A：OSCC 腫瘤組織（T）和癌旁正?？谇火つそM織（N）中 ENPP1 的蛋白質(zhì)印跡圖；B：ENPP1 的蛋白質(zhì)印 跡分析結(jié)果（n＝8，*P＜0.05vs 正常組 N）；C.D：OSCC 腫瘤組織（T）和正?？谇火つそM織（N）中 ENPP1 的免疫組織 化學(xué)染 色的代表性圖像和評(píng)分（n＝16，*P＜0.05vs 正常組 N）。比例尺＝100μm。

圖2 下調(diào) ENPP1 能夠抑制 OSCC 細(xì)胞的干細(xì)胞表型A：ENPP1 在3種OSCC細(xì)胞系（CAL-27，Tac-8113，SCC-9）和正常人口腔粘膜細(xì)胞系中的表達(dá)和分析 （n＝3，*P＜0.05vs hOMF 細(xì)胞組）；B：CAL-27細(xì)胞用非特異性 shNS 或 shENPP1-#1 和 shENPP1-#2 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，檢測(cè)ENPP1 的表達(dá) （n＝3，*P＜0.05 vs NS 組）；C：CAL-27 NS 或 shENPP1-#1 細(xì)胞系中 ABCG2，SOX2，NANOG 和 CD44 的癌癥干細(xì)胞 marker 的表達(dá)和分析（n＝3，*P＜0.05 vs NS 組）

筆者通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖遷移，發(fā)現(xiàn)CAL-27-NS細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)迅速增殖，而CAL-27-shENPP1 細(xì)胞增殖速度顯著降低（圖 4A，4B）。TGF-β處理（5ng/ml）48小時(shí)之后，CAL-27-NS 和 CAL-27-shENPP1 細(xì)胞的遷移活性均增加，但兩組仍存在顯著差異（圖4C，4D）。結(jié)合圖3表明，ENPP1 在誘導(dǎo) OSCC 細(xì)胞 EMT 轉(zhuǎn)化和遷移中起到重要作用。

圖3 ENPP1 敲低降低了 TGF-β 誘導(dǎo)的 EMTA、B：CAL27-NS 和 CAL27-shENPP1 細(xì)胞系用 TGF-β（5ng/ml） 處理 2天。免疫熒光染色分析 vimentin（綠色）和 E-cadherin（紅色）的表達(dá)，通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì) DAP（I藍(lán)色）進(jìn)行成像。比例尺＝100μm。

圖4 ENPP1 敲低降低了 CAL-27 的遷移A：CAL27-NS 和 CAL27-shENPP1 細(xì)胞系 48 小時(shí)遷移分析圖，比例尺＝200μm；B：細(xì)胞遷移能力分析 （n＝3，*P＜0.05 vs CAL-27-NS）；C：TGF-β（5ng/ml）處理 48 小時(shí)后，CAL27-NS 和 CAL27-shENPP1 細(xì)胞系遷移分析圖，比例尺＝200μm；D：TGF-β（5ng/ml）處理細(xì)胞的遷移能力分析（n＝3，*P＜0.05 vs CAL-27 細(xì)胞 NS）。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與正?？谇火つそM織相比，ENPP1在 OSCC 患者腫瘤組織中大概率表達(dá)上調(diào)。筆者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)敲低 ENPP1 的表達(dá)，有效抑制了 OSCC細(xì)胞干性，遷移活性和 EMT 表型，結(jié)果證實(shí) ENPP1在維持 OSCC 的干性和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

ENPP1 是一種膜蛋白，可以水解三磷酸，二 磷酸和一磷酸核苷和二磷酸核苷多磷酸，并生成二磷酸核苷，一磷酸核苷，核苷，磷酸和無(wú)機(jī)焦磷酸鹽（PPi）[10]。已有研究顯示 ENPP1 在多種腫瘤惡化和發(fā)展中起重要作用，例如乳腺癌和肺癌[6，8]。本研究發(fā)現(xiàn) ENPP1 在 OSCC 腫瘤組織中表達(dá)較正常粘膜明顯升高。同時(shí)通過(guò) GEO2R 軟件分別對(duì) Affymetrix 芯片數(shù)據(jù)集 GSE3524[11]和 GSE31853[12]中 ENPP1 mRNA 的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn) ENPP1 mRNA 在OSCC 特別是高分化 OSCC 腫瘤組織中高表達(dá)。結(jié)合筆者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證實(shí) ENPP1 與 OSCC 的惡化和發(fā)展密切相關(guān)。

腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限分裂增殖能力，其干細(xì)胞特性使得腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療藥物產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療困難[13]。筆者發(fā)現(xiàn)，ENPP1shRNA 處理OSCC 細(xì)胞系 CAL-27 后，CAL-27-shENPP1 細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物NANOG、ABCG2、SOX2 和CD44 的表達(dá)顯著降低。已有研究顯示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 CSC 中 ENPP1 mRNA 的表達(dá)較正常組織顯著升高，這與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中干性表型的增加有關(guān)[7]。本文結(jié)果也表明 ENPP1 在維持 OSCC 細(xì)胞干性中的重要作用，與文獻(xiàn)結(jié)果報(bào)道一致。

有研究顯示，EMT 對(duì)于誘導(dǎo)和維持干細(xì)胞樣特征至關(guān)重要[14]。OSCC 是上皮來(lái)源的惡性腫瘤，上皮細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá)降低預(yù)示著上皮細(xì)胞粘附的喪失，已被證實(shí)在 OSCC 的發(fā)展和預(yù)后中起關(guān)鍵因素[15]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞以及癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞可促進(jìn)癌細(xì)胞 EMT 轉(zhuǎn)化，通過(guò)啟動(dòng)多條調(diào)控通路（ERK1/2/JNK、TGFb1/smad）[16]，從而導(dǎo)致OSCC 的進(jìn)展[17，18]。筆者將 CAL-27 細(xì)胞敲低 ENPP1，發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)化顯著降低，同時(shí)CAL-27 細(xì)胞的遷移和增長(zhǎng)也顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn) ENPP1 在維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的間質(zhì)化表型中發(fā)揮重要作用[7]。因此 ENPP1在OSCC 間質(zhì)化表型和干細(xì)胞特征維持中起重要作用，然而 ENPP1 在介導(dǎo)EMT 和干性功能中是否通過(guò)類(lèi)似通路機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究探索 ENPP1 的調(diào)控機(jī)制。