孫 旭 李 寧 張旭東 楊月美 白冰清

黑色素瘤是一種來源于黑色素細(xì)胞的腫瘤，近年來已經(jīng)成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快、死亡率最高的腫瘤之一[1]。隨著分子免疫學(xué)的飛速發(fā)展，學(xué)者們逐漸了解到黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展與患者的免疫功能密切相關(guān)[2]。T 淋巴細(xì)胞各種亞型的數(shù)量及活性是機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要體現(xiàn)[3]。第 10 號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶－張力蛋白（PTEN）作為一種抑癌基因，它的正常表達(dá)可以影響宿主的免疫反應(yīng)[4]。PTEN 失活可出現(xiàn)在多種腫瘤組織中，參 與腫瘤的發(fā)生、發(fā) 展過程[5]。本研究通過檢測(cè) T 細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例，探索 PTEN 在黑色素瘤免疫逃逸中的機(jī)制。

資料和方法

健康C57BL/6小鼠74只，8～10周齡體重16～20 克，雌性，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)SCXK（冀）2017-1-0008）。（PTEN+/+-B16F10）細(xì)胞株、（PTEN-/--B16F10） 細(xì)胞株 （上海中橋新舟公司）。FITC Anti-mouse CD3（美國(guó)Tonbo Biosciences公 司 ）；FITC Anti-mouse CD4 （美國(guó)Tonbo Biosciences 公司）；PE Anti-mouse CD8（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司）；PE/Cy5 Anti-mouse CD28（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司）。

建立PTEN不同表達(dá)的荷瘤小鼠模型：將PTEN+/+-B16F10，PTEN-/--B16F10 細(xì)胞（圖 1、2）分別皮下接種同系 C57BL 小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組（A＝24；B＝25；C＝25）：A 組注入 0.2ml 的 RPMI-1640培養(yǎng)液；B組注入0.2ml濃度為4×106/ml 的（PTEN+/+-B16F10）；C組注入0.2ml濃度為4×106/ml的（PTEN-/--B16F10）。模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)：B 組、C 組小鼠背部可見直徑約為5mm大小黑結(jié)節(jié)，突出皮膚表面。分別 B、C 組各取一只動(dòng)物，取腫瘤組織免疫印跡法檢測(cè) PTEN 表達(dá)情況。

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察 PTEN+/+-B16F10 細(xì)胞（×100）a：培養(yǎng)三天的細(xì)胞圖像，b：胰酶消化后的細(xì)胞圖像。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察 PTEN-/--B16F10 細(xì)胞（×100）c：培養(yǎng)三天的細(xì)胞圖像，d：胰酶消化后的細(xì)胞圖像。

免疫細(xì)胞表面分子染色：接種腫瘤細(xì)胞第7天（D7）開始，每隔5天，隨機(jī)選取 A、B、C組各6只小鼠。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量為 0.3ml/100g 體重，麻醉起效后處死，設(shè)計(jì)腹腔切口，無(wú)菌分離脾臟，EP 管中剪碎，研磨，沖洗，收集細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞2分鐘，1200r/min 離心10min 后棄去上清，重懸，計(jì)數(shù)。準(zhǔn)備18支流式管，分3組，每組6支，對(duì)應(yīng)加入細(xì)胞，數(shù)量約 1×107個(gè)，體積 100 微升，將 CD3、CD4、CD8、CD28 抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)，避光染色 30min。細(xì)胞染色緩沖液離心洗滌2次，1000r/min，10min，充分混勻、避 光30min，PBS 重懸100～200 微升，操作均在 4℃冰盒上進(jìn)行。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)：EPICSXL 流式細(xì)胞儀對(duì)制備好的流式樣本上機(jī)檢測(cè)。測(cè)定各亞型淋巴細(xì)胞表面各種熒光素的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度以二維 dot-plot散點(diǎn)圖儲(chǔ)存于電腦中。自動(dòng)分析結(jié)合某一單抗的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和百分比得到 CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+/CD8+百分?jǐn)?shù)。檢測(cè)結(jié)果采用 FlowJo software軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.細(xì)胞生長(zhǎng)情況：培養(yǎng)3天的PTEN+/+-B16F10細(xì)胞、PTEN-/--B16F10 細(xì)胞可見呈梭形，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞棱角變頓，細(xì)胞貼于無(wú)菌培養(yǎng)瓶底。培養(yǎng)7～8 天后，可見細(xì)胞已鋪滿瓶底，胰酶消化后細(xì)胞收縮成顆粒、球狀、可活動(dòng)（圖 1、2）。

2.實(shí)驗(yàn)組小鼠模型建立和鑒定：接種腫瘤細(xì)胞第 7 天，可見 B 組、C組小鼠背部均觸及直徑約為5mm 大小黑結(jié)節(jié)，突出皮膚表面，成瘤率 100%。提取腫瘤組織蛋白免疫印跡檢測(cè)鑒定 B 組小鼠腫瘤標(biāo)本 PTEN 蛋白表達(dá)，C 組小鼠不表達(dá)，成功構(gòu)建荷瘤小鼠模型（圖 3）。

圖3 荷瘤小鼠 PTEN 的表達(dá)

3.CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+T細(xì)胞表達(dá)（表1、表2、表3、表4）：對(duì)照組（A 組）小鼠脾臟組織中CD3+T、CD4+T 比例及數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，D7、D12、D17 組內(nèi)比較（P＞0.05），分別與 D22比較 （P＜0.05）。CD8+T、CD28+/CD8+比例及數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)基本平穩(wěn)（P＞0.05）。兩組荷瘤小鼠脾臟組織中 CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD28+/CD8+比例及數(shù)量隨著腫瘤的增長(zhǎng)降低，D7、D12，C 組 ＜B 組，（P＞0.05）；D17、D22，C 組＜B 組（P＜0.05）；B 組 、C組各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較 （P＜0.05）。B 組下降幅度：CD3+T 為 79.8% 、CD4+T 為 82.6% 、CD8+T 為 65.37%、CD28+/CD8+為 58.69%。C 組下降幅度：CD3+T為 89.62% 、CD4+T 為 89.24% 、CD8+T 為 84.85% 、CD28+/CD8+為 70.53%。對(duì)照組與荷瘤組比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn) B 組＜A 組；C 組＜A 組（P＜0.05）。

表1 各組小鼠脾臟組織中 CD3+T 淋巴細(xì)胞相對(duì)

表2 各組小鼠脾臟組織中 CD4+T 淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量

表3 各組小鼠脾臟組織中 CD8+T 淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量

表4 各組小鼠脾臟組織中 CD28+/CD8+T 細(xì)胞比例

討 論

黑色素瘤是來源于黑色素細(xì)胞的腫瘤，目前免疫治療是晚期患者的主要治療方法但是存在效果不明顯而限制其應(yīng)用[6]。近年來學(xué)者發(fā)現(xiàn)大量的腫瘤抗原尤其是 T 細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原，在細(xì)胞和分子學(xué)水平探索腫瘤與免疫系統(tǒng)相關(guān)性[7]。PTEN 是 1997年由美國(guó)三個(gè)獨(dú)立研究小組在人類第 10 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)的一種具有雙特異性磷酸酶活性強(qiáng)大的的腫瘤抑制基因。腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境以及腫瘤細(xì)胞通過自身的改變適應(yīng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境來逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別或攻擊有著密切的關(guān)系[8]。

大量研究表明T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[9]。T 淋巴細(xì)胞作為重要的免疫應(yīng)答者，參與具有免疫原性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并發(fā)揮自身的調(diào)控作用，其亞群的功能也一直是學(xué)者們研究的重點(diǎn)[10]。T 細(xì)胞表達(dá) MHC Ⅰ類抗原，同時(shí)還表達(dá)多種分化抗原 CD 分子。T 細(xì)胞缺陷會(huì)激 活機(jī)體免疫，腫瘤的發(fā)生使得免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤應(yīng)答，而腫瘤本身通過免疫消除、相持、逃逸來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[11]。T 細(xì)胞的數(shù)量變化可以體現(xiàn)腫瘤發(fā)生 發(fā)展的情況。研究表明 CD8+CTL 細(xì)胞是一種能夠特異性殺傷性 T 細(xì)胞，而后學(xué)者發(fā)現(xiàn) CD28 是一種特異性表達(dá) CTL 細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞[12]。本研究表明：CD 分子作為 T 細(xì)胞的表面抗原，其數(shù)量和比例可以反 映出機(jī)體對(duì)于外界刺激的反應(yīng)，尤其是腫瘤形成對(duì)免疫力的影響。在正常小鼠體內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明隨之時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠免疫力逐漸下降。兩組荷瘤小鼠脾臟組織中各指標(biāo)組內(nèi)比較均有顯著性差異。考慮當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定程度后，在與機(jī)體的對(duì)抗中，嚴(yán)重的破壞了自身免疫狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境，這也與后期腫瘤體積增大一致，因腫瘤的存在，抵抗力明顯降低。PTEN 基因缺失使得小鼠抵抗腫瘤的免疫 力降低，而這種作用在腫瘤發(fā)生初期表現(xiàn)不明顯，隨之腫瘤的增長(zhǎng)，PTEN基因參與機(jī)體抵抗腫瘤過程作用凸顯，基因缺失使得腫瘤細(xì)胞得以免疫逃逸。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠機(jī)體免疫應(yīng)答持續(xù)進(jìn)行，且在后期機(jī)體防御系統(tǒng)呈現(xiàn)弱勢(shì)，當(dāng)機(jī)體面對(duì)腫瘤發(fā)生時(shí)，表現(xiàn) CD 分子表達(dá)減弱明顯，機(jī)體免疫力減低地更快。