武鑫，孫寧寧，王冬慧，張松江，高劍峰

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，鄭州 450046)

前期實(shí)驗(yàn)研究表明采用 X射線照射實(shí)驗(yàn)小鼠后，可造成小鼠新物體認(rèn)知能力的損傷，表現(xiàn)為在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中放射線照射小鼠垂直及水平運(yùn)動(dòng)時(shí)間、修飾次數(shù)較對(duì)照組小鼠均顯著減少，而在新物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中放射線照射小鼠在兩個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)新物體探索時(shí)間及認(rèn)知指數(shù)均明顯下降[1]。不同療程電針干預(yù)可抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，一定程度逆轉(zhuǎn)上述由放射線照射所導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷[2]。已有研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬區(qū)是對(duì)放射線照射最敏感的核團(tuán)，X射線照射可產(chǎn)生大量的自由基，嚴(yán)重?fù)p傷該區(qū)域神經(jīng)元的形態(tài)功能以及突觸傳遞功能，最終引起腦組織退行性病變[3-4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元通過(guò)形成功能性的突觸相互聯(lián)系，構(gòu)成神經(jīng)回路發(fā)揮功能。突觸可塑性是指突觸在數(shù)量、形態(tài)和功能上有序地發(fā)生變化，是大腦學(xué)習(xí)記憶功能的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上，探討電針干預(yù)對(duì)放射線照射小鼠海馬區(qū)依賴性空間學(xué)習(xí)記憶功能以及突觸結(jié)構(gòu)功能的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40只健康清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，雄性，1月齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)11400700063049)。將小鼠置于 7:00—19:00光照和19:00—7:00黑暗的實(shí)驗(yàn)室，食水不限。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組10只、放射線照射組(8 Gy)10只、電針穴位組10只、電針?lè)茄ㄎ唤M10只。

1.2 主要儀器與試劑

全自動(dòng)Morris Water Maze(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);直線加速器(Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA);電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司，G6805-2A);石蠟切片機(jī)(Leica，型號(hào) 2235);體視學(xué)顯微鏡(Leica，型號(hào) M205FA);投射顯微鏡(日立，型號(hào) H-7500);圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA，型號(hào) 41N5100-44800);低溫高速離心機(jī)(日立，CF6RXⅡ);核酸定量?jī)x(島津，Biospec-nano);生物分子成像儀(富士，LAS-4000MINI);凝膠成像儀(Bio-Rad);syanpsin 1抗體(Abcam，ab64581);β-actin抗體(Abcam);HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2301)，PageRμl er? Prestained Protein Ladder(Fermentas，SM0671)，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司，300000-B)，eECL Western Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0049)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 X射線照射方法[1]

雄性 C57BL/6J小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)麻醉，將動(dòng)物俯臥位固定于放射平臺(tái)，左側(cè)大腦半球照射范圍 1 cm×2 cm，射線源距離腦99.5 cm，照射劑量為8 Gy，劑量率為400 cGy/min，照射過(guò)程約持續(xù)10 min，采用PRIMUS型高能醫(yī)用電子直線加速器X射線進(jìn)行照射。用鉛模覆蓋避免呼吸肌消化道系統(tǒng)損傷，照射完成后將動(dòng)物送回鼠籠，電針穴位組和電針?lè)茄ㄎ唤M第2天開(kāi)始給予電針干預(yù)。

1.3.2 電針干預(yù)

電針?lè)椒▍⒖及l(fā)表文獻(xiàn)[6]，電針穴位組取百會(huì)(頂骨正中)、風(fēng)府(枕骨頂嵴后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處，雙側(cè)腎俞(第2腰椎后兩旁凹陷處)，用無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，0.30 mm×13 mm)向后斜刺入，深度約1 mm，連接電針儀，百會(huì)、風(fēng)府接1組，雙側(cè)腎俞接1組，參考文獻(xiàn)[7]設(shè)置刺激參數(shù)，電壓1.5 V，頻率10 Hz，波寬1 ms，電針時(shí)間每次30 min，每日1次，連續(xù)電針干預(yù)3周。電針?lè)茄ㄎ唤M取尾根前 0.5 cm，后背正中線旁開(kāi)0.3 cm;尾根前1.0 cm，后背正中線旁開(kāi)0.3 cm，電針?lè)椒ê童煶掏娽樠ㄎ唤M。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參考發(fā)表文獻(xiàn)[8]。水迷宮儀器為一直徑160 cm、高50 cm的圓形水池，內(nèi)壁為黑色，池內(nèi)水深30 cm，水溫為(22±2)℃，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線恒定，水池周圍為豎起的不透光圍簾，保證無(wú)光線直射入水池內(nèi)。水池壁上的4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，并將第 3象限設(shè)為靶象限，在第 3象限距離池壁約40 cm處放置一直徑為 10 cm的透明平臺(tái)，高 28 cm，位于水面下2 cm處。水迷宮上方安置有攝像機(jī)，與電腦主機(jī)相連，同步記錄各組小鼠運(yùn)行軌跡。定位航行實(shí)驗(yàn)將各組小鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，每日1次。具體訓(xùn)練方法為將各組受試小鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来斡?E、S、W、N入水點(diǎn)放入水中，并記錄小鼠在2 min內(nèi)從尋找到水下平臺(tái)所需的時(shí)間(即潛伏期)。如果小鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員將其引至平臺(tái)上并停留10 s，然后將其送回鼠籠中。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將目的象限的平臺(tái)撤去，從同一入水點(diǎn)將各組小鼠放入水中，并記錄其在2 min內(nèi)在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間以及穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)。

1.3.4 透射電鏡檢測(cè)突觸超微結(jié)構(gòu)

取固定的海馬組織樣品PBS漂洗4次，每次10 min，然后進(jìn)行1%鋨酸后固定1.5 h，PBS漂洗，脫水處理按30%→50%→70%(過(guò)夜)→90%→100%Ⅰ丙酮濃度脫水，再次浸入100%Ⅱ、Ⅲ丙酮各45 min，然后環(huán)氧樹(shù)脂812添加 4 h后聚合包埋，反應(yīng)條件為 37℃ 12 h→45℃12 h→60℃ 24～48 h。待包埋組織完全聚合完畢后進(jìn)行修整切片，切片厚度為 70 nm。超薄切片進(jìn)行染色，染色方法為檸檬酸鉛5 min→醋酸雙氧鈾25 min。透射電鏡觀察并進(jìn)行拍照，每組選取3只小鼠，每只小鼠選取 5個(gè)海馬切片觀察海馬區(qū)突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)突觸間隙及突觸后致密物厚度。

1.3.5 突觸蛋白-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

突觸蛋白-1基因表達(dá)RT-qPCR檢測(cè)，取各組小鼠海馬區(qū)新鮮組織置于液氮3 h，然后移入﹣80℃冰箱備用。利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/286 nm吸光度比值及瓊脂糖電泳鑒定其純度。RT-qPCR方法，采用Prime Premier 5.0設(shè)計(jì) 引 物 ，synapsin-1(正 義 鏈 為5’-ATCCTCTCCTGGAGCTCTGA-3’， 反 義 鏈 為5’-GGGCTTCTTATGGAATTGGA-3’，95℃ 預(yù) 變 性1 min，95℃變性 15 s，60℃退火 1 min)。內(nèi)參基因β-actin(正義鏈為 5’CAGGCATTGCTGACAGGATG-3’，反義鏈為3’-TGCTGATCCACATCTGCTGG-5’)。PCR產(chǎn)物用含 0.5 μg/mL溴乙啶的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，LAS1000 CCD曝光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。突觸蛋白-1表達(dá)Western blot檢測(cè)取﹣80℃保存的小鼠海馬區(qū)腦組織(約 50 mg)放入預(yù)冷號(hào)的研缽中加入液氮研磨成粉末狀。

1.3.6 突觸蛋白-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

常規(guī)組織蛋白質(zhì)提取，將標(biāo)本加入等量 3×SDSPAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)緩沖液，96℃加熱 5 min，樣本采用4%～20%的Tris-Glycine膠電泳90 min分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至硝基纖維膜。硝基纖維膜采用含5%脫脂牛奶的 TBST-T(30 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20)室溫振蕩封閉1 h，然后用 1×TBST-T反復(fù)洗滌后與 synapsin-1一抗(1:500稀釋)室溫4℃過(guò)夜孵育。取出膜用TBST4次，每次 5 min，漂洗過(guò)后與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:1000稀釋)室溫振蕩孵育1 h，TBST洗滌后在顯色底物液(Pierce，Rockford，IL)中顯色 5 min，采用 LAS1000 CCD曝光系統(tǒng)檢測(cè)特異性條帶，并以β-actin為內(nèi)參蛋白對(duì)樣品條帶進(jìn)行半定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)合Tukey’s multiple comparisons test檢驗(yàn)，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析結(jié)合Tukey’s multiple comparisons test檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針干預(yù)對(duì)放射線照射小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響

水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組比較，放射線照射組小鼠潛伏期呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，其中在第 2天至第 5天兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第2天P＜0.05，第3天P＜0.05，第4天P＜0.01，第5天P＜0.01)。而與放射線照射組比較，電針穴位組則在第3天(P＜0.01)、第4天(P＜0.01)以及第5天(P＜0.01)尋找平臺(tái)潛伏期顯著縮短。此外，放射線照射組與電針?lè)茄ㄎ唤M之間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明放射線照射組小鼠在穿越平臺(tái)所在目的象限次數(shù)以及在目的象限停留時(shí)間均較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)。而電針穴位干預(yù)后小鼠的上述兩項(xiàng)指標(biāo)均顯著增加，并且與放射線照射組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，電針?lè)茄ㄎ唤M則沒(méi)有上述影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 電針干預(yù)對(duì)小鼠尋找平臺(tái)潛伏期及空間探索能力的影響

2.2 電針干預(yù)對(duì)放射線照射小鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明電針干預(yù)可一定程度改善放射線照射所致的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，而海馬區(qū)突觸功能是學(xué)習(xí)記憶的分子學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此檢測(cè)了各組小鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的改變。在同一倍數(shù)下觀察各組小鼠海馬區(qū)可見(jiàn)，對(duì)照組突觸數(shù)量最多，結(jié)構(gòu)明確且完整，突觸間隙清晰。而放射線照射組突觸間隙不清晰，結(jié)構(gòu)不完整，電針穴位組較放射線照射組有所改善，突觸結(jié)構(gòu)明確，間隙較為清晰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)突觸間隙及突觸后致密區(qū)厚度均發(fā)生了明顯變化，如圖中矩形標(biāo)示突觸間隙顯著減小(P＜0.05)，如圖中箭頭標(biāo)示突觸后致密區(qū)厚度也顯著減小(P＜0.01)。而與放射線照射組比較，電針穴位組小鼠海馬區(qū)突觸間隙增加(P＜0.05)，突觸后致密區(qū)厚度也顯著增加(P＜0.05)。電針?lè)茄ㄎ唤M不具有上述影響作用，變化不明顯。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 電針干預(yù)對(duì)小鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響

2.3 電針干預(yù)對(duì)放射線照射小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1表達(dá)的影響

進(jìn)一步從基因與功能蛋白表達(dá)兩個(gè)水平檢測(cè)了海馬區(qū)與突觸傳遞效應(yīng)密切相關(guān)的功能蛋白突觸蛋白-1的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1基因表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，而電針干預(yù)后該基因表達(dá)則顯著升高(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示海馬區(qū)突觸蛋白-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與對(duì)照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.01)，而電針穴位干預(yù)后小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1蛋白表達(dá)水平較放射線照射組顯著增加(P＜0.05)，電針?lè)茄ㄎ唤M則沒(méi)有上述變化。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 電針干預(yù)對(duì)小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1表達(dá)的影響

4 討論

學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)功能之一，所涉及的腦區(qū)復(fù)雜，并且與不同腦區(qū)的蛋白分子變化密切相關(guān)。其中海馬區(qū)是公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程密切相關(guān)的功能腦區(qū)[9-11]。海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)及功能的損傷會(huì)影響新事物學(xué)習(xí)及記憶過(guò)程[12]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射線照射可顯著損傷小鼠新物體認(rèn)知功能，給予電針穴位干預(yù)則一定程度改善了上述損傷作用。Morris水迷宮是廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)價(jià)的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[13-14]，可以較為客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在水迷宮實(shí)驗(yàn)中放射線照射組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期顯著增加，穿越平臺(tái)所在目的象限次數(shù)和在目的象限停留時(shí)間顯著減少，而給予電針穴位干預(yù)可使小鼠尋找平臺(tái)潛伏期顯著縮短，穿越平臺(tái)所在目的象限次數(shù)增加，在目的象限停留時(shí)間延長(zhǎng)。電針?lè)茄ㄎ唤M則沒(méi)有上述影響。上述行為學(xué)結(jié)果說(shuō)明電針穴位有效地促進(jìn)了放射線照射小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元之間通過(guò)形成功能結(jié)構(gòu)——突觸相互聯(lián)系構(gòu)成神經(jīng)回路。到目前為止，大量研究認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶的獲得、儲(chǔ)存與再提取需要突觸在數(shù)量結(jié)構(gòu)以及功能上發(fā)生改變，這種有序的變化被稱為突觸可塑性[17-18]。突觸可塑性被公認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[19]。而臨床上一些與認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)記憶功能損傷相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病均與突觸病理性改變密切相關(guān)[20-21]。邊緣系統(tǒng)是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能的核心腦區(qū)[海馬區(qū)作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，位于顳葉內(nèi)腹側(cè)]，由海馬和齒狀回兩部分組成，被公認(rèn)為與空間學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[22]。海馬區(qū)突觸功能損傷會(huì)影響整體行為學(xué)的改變，研究報(bào)道海馬損傷后小鼠短期記憶丟失并且無(wú)法形成新的記憶[23]。突觸蛋白-1 (synapsin-1)是一種與突觸結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)的功能蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)突觸囊泡的移動(dòng)，突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。有研究表明早期給予麻醉劑可減少突觸蛋白-1的表達(dá)，干擾突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育并導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[24]。因此，突觸蛋白-1通過(guò)調(diào)控突觸前傳遞的效應(yīng)在突觸可塑性中發(fā)揮了重要的作用。有研究表明電針具有促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，改善突觸超微結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)突觸可塑性等功能[25]。突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density，PSD)是指突觸后膜內(nèi)側(cè)一層分布均勻的致密物質(zhì)，其中包括有可與突觸前釋放的神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的受體、蛋白信號(hào)分子以及細(xì)胞骨架蛋白等[26]。有研究表明PSD蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)突觸后谷氨酸受體的動(dòng)力學(xué)變化在突觸功能以及可塑性過(guò)程中發(fā)揮生理及病理學(xué)作用[27]。本實(shí)驗(yàn)水迷宮實(shí)驗(yàn)明確電針穴位改善了放射線照射小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放射線照射組小鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和間隙均出現(xiàn)明顯損傷，突觸間隙減小，PSD厚度下降，而電針穴位組小鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)較明確，突觸間隙清晰，突觸間隙以及PSD厚度較放射線照射組均顯著增加。此外，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示放射線照射組小鼠海馬區(qū)突觸蛋白-1基因及蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著下降，而給予電針穴位干預(yù)則顯著提高了突觸蛋白-1的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明電針穴位可通過(guò)上調(diào)海馬區(qū)突觸蛋白-1的表達(dá)改善放射線照射小鼠突觸結(jié)構(gòu)以及功能，增強(qiáng)突觸的可塑性，從而在整體水平增強(qiáng)了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。

本研究利用整體行為學(xué)以及分子生物學(xué)方法探討了電針穴位對(duì)放射線照射所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能損傷的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)了與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵突觸蛋白的作用，結(jié)果表明電針穴位改善了放射線照射小鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為損傷，這一影響作用與突觸結(jié)構(gòu)改變以及突觸蛋白-1表達(dá)水平上調(diào)密切相關(guān)，說(shuō)明電針穴位的改善作用機(jī)制與突觸可塑性有關(guān)，具體蛋白信號(hào)通路需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探明。