馮濤，張麗萍

(1.菏澤市中醫(yī)醫(yī)院，菏澤 274000;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬威海醫(yī)院，威海 264200)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是腰腿痛的一種最為常見的原因，是臨床上的常見疾病，好發(fā)于30～50歲的體力勞動者或者平時缺乏鍛煉的人[1-2]。椎間盤突出等一系列的脊柱退行性病變均會對神經(jīng)根造成不同程度的壓迫，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)損傷并誘發(fā)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯等現(xiàn)象的出現(xiàn)，臨床上可以表現(xiàn)為慢性腰背痛與坐骨神經(jīng)痛等癥狀，它的根本病理變化就在于病變部位神經(jīng)根的損傷。統(tǒng)計資料顯示，近80%的人一生中或輕或重曾患有下腰痛，在這之中，大多數(shù)患者是由于腰椎間盤突出所引起的。目前的研究表明，椎間盤移位后釋放大量化學(xué)介質(zhì)，繼發(fā)無菌性神經(jīng)根炎而產(chǎn)生的炎癥致痛學(xué)說已受到國際醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)，并逐步取代了單純的機械壓迫學(xué)說[3-5]。本實驗以LDH根性神經(jīng)痛SD大鼠為研究對象，通過針刀松解治療后，檢測各組大鼠在實驗過程中后肢熱刺激縮爪的潛伏期、下丘腦與血漿中生物活性因子八肽膽囊收縮素(CCK-8)、中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)5-羥色胺(5-HT)含量的變化，研究針刀松解法對LDH根性神經(jīng)痛SD大鼠下丘腦與血漿中CCK-8、5-HT含量的影響，探討針刀松解對LDH根性神經(jīng)痛SD大鼠在提高生物活性、中樞鎮(zhèn)痛等方面的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD雄性大鼠(240～270 g)40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、針刀組、電針組，每組10只。4組均參加造模。

1.2 模型制備

用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，將其背部脫毛之后以俯臥位固定在鋪有無菌手術(shù)巾的手術(shù)臺上面，并將手術(shù)區(qū)域暴露出來，用碘伏對大鼠暴露的手術(shù)部位進(jìn)行消毒處理，將L3-4棘突作為中心區(qū)域，于大鼠背部正中部位取大約3 cm長的切口，依次切開大鼠背部的皮膚、皮下組織與腰背筋膜層，將其背部組織進(jìn)行鈍性分離，直至暴露腰椎旁肌，將其牽開后，用微型咬骨鉗將左側(cè)L4棘突及右側(cè)椎板、關(guān)節(jié)突咬除，暴露L4神經(jīng)根，將4-0鉻制腸線環(huán)扎在L4神經(jīng)根處，其松緊度以腸線接觸到神經(jīng)根但無明顯壓迫為宜。將切口進(jìn)行逐層縫合，并灑上青霉素粉末，在術(shù)后3 d內(nèi)每日給予大鼠青霉素肌注以預(yù)防其手術(shù)可能誘發(fā)的感染，劑量為8萬U/d。

評價模型:等到大鼠于術(shù)后清醒之后，觀察手術(shù)大鼠雙下肢有沒有癱瘓的情況出現(xiàn)(主要表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)或者足外翻)，來判定造模是否造成了對大鼠脊髓的損傷。如果沒有癱瘓的情況，就對手術(shù)大鼠兩側(cè)的后足檢測熱刺激痛覺過敏情況，將大鼠放置在PL-200型熱痛測試儀的檢測盒之中，輻射熱光源經(jīng)過底部的玻璃板聚焦于大鼠一側(cè)足底的后半部位，其光斑直徑為5 mm。把大鼠從開始照射到產(chǎn)生縮爪的時間記錄下來。每次測試間隔至少為5 min，測量3次取其平均值，對大鼠的兩側(cè)后足進(jìn)行交替檢測。根據(jù)各次檢測的平均值求出大鼠兩后足進(jìn)行熱刺激后發(fā)生縮爪的潛伏期，按公式術(shù)前潛伏期－術(shù)后潛伏期加以計算，其差值比正常大鼠組的差值大則說明潛伏期下降，對熱痛反應(yīng)發(fā)生了痛覺過敏現(xiàn)象，這提示造模成功。

經(jīng)檢測，各組大鼠均造模成功。

1.3 各組處理手段

假手術(shù)組:手術(shù)過程同造模各組，但不用4-0鉻制腸線環(huán)扎在L4神經(jīng)根處。手術(shù)后正常飼養(yǎng)。

模型組:造模之后正常飼養(yǎng)。

針刀組:造模之后3 d后給予針刀干預(yù)治療。施行針刀時先用乙醚將大鼠麻醉約1 min，使大鼠不能出現(xiàn)強烈掙扎。選用HZ系列一次性針刀進(jìn)行干預(yù)，規(guī)格為0.4 mm×40 mm(由北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。其治療點選擇患椎上下棘之間、患椎上下棘間旁開0.1 cm處，患椎上下橫突，臀上皮神經(jīng)走行區(qū)域、坐骨神經(jīng)出口處等部位的條索、結(jié)節(jié)、壓痛點等位置，每次選擇2～3個點進(jìn)行松解。每周干預(yù)1次，共干預(yù)3次。

電針組:造模之后3 d后給予電針干預(yù)治療。取大鼠的環(huán)跳、委中穴。取穴方法主要參照《實驗針灸學(xué)》教材，并且與動物比較學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合，依據(jù)比較解剖取穴法配合模擬骨度取穴法最終確定穴位的具體位置。選用一次性無菌針灸針，規(guī)格為0.2 mm×13 mm(環(huán)球牌，由蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn))。針刺后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，頻率2～100 Hz，電流強度以造成大鼠后肢輕度抖動為宜，每次刺激20 min。隔日治療1次，1周治療3次，共治療3周。

1.4 取材與檢測指標(biāo)

后肢熱刺激縮爪潛伏期的檢測:假手術(shù)組、模型組、電針組、針刀組大鼠分別在造模結(jié)束后及治療第1周、第2周、第3周對兩側(cè)后肢熱刺激縮爪潛伏期進(jìn)行檢測，檢測方法如上述，并按公式，術(shù)前潛伏期－術(shù)后潛伏期進(jìn)行計算，得出差值。在治療結(jié)束后24 h之內(nèi)進(jìn)行取材。

血漿:取l%肝素(100 L/mL血樣)處理試管，干燥后備用。采血之前每個試管加入抑肽酶20 L/mL的血樣，對SD大鼠進(jìn)行眼眶取血，然后注進(jìn)肝素管之內(nèi)，將該管充分搖勻后，立即放置于4℃冰箱中，3 h內(nèi)以4000 r/min的速度進(jìn)行低溫離心，這一過程共進(jìn)行10 min，然后進(jìn)行血漿的分離，最后放置在-70℃環(huán)境中保存，等待檢測。

腦組織:在枕骨大孔水平斷頭處死，從枕骨大孔處開顱取出腦組織，在冰盤上分離出大鼠的下丘腦，并制作成腦勻漿，并于冰皿上編號，樣品稱重記錄后置于生理鹽水中煮沸3 min，再加入1N冰醋酸0.5 mL，充分勻漿，以1N NaOH 0.5 mL中和，3000 r/min低溫離心15 min，取上清液于-70℃環(huán)境中保存，等待檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有檢測數(shù)據(jù)使用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計。檢測數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布，對于符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析。當(dāng)方差分析有顯著意義時，進(jìn)行多組間兩兩比較，在方差齊時采用Bonferroni法，而方差不齊時采用Tamhane法。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠后肢熱刺激縮爪潛伏期比較

表1顯示，模型組在術(shù)后第1周時開始出現(xiàn)術(shù)側(cè)后足熱刺激縮爪潛伏期縮短(熱刺激痛覺過敏現(xiàn)象)，與術(shù)前及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);第3周時潛伏期縮短最明顯，與術(shù)前及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);針刀組、電針組大鼠在治療第2周時開始出現(xiàn)兩足熱刺激縮爪潛伏期差值明顯減小(熱刺激痛覺過敏現(xiàn)象減輕)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。假手術(shù)組大鼠在各時相點熱刺激縮爪潛伏期差值與針刀組、電針組比統(tǒng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠后肢熱刺激縮爪潛伏期比較 (±s，s)

表1 各組大鼠后肢熱刺激縮爪潛伏期比較 (±s，s)

注:與模型組比較1)P＜0.01;與假手術(shù)組比較2)P＜0.01，3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.01

組別 n 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周假手術(shù)組 10 1.01±1.12 1.01±1.00 0.98±1.00 1.01±0.72模型組 10 1.09±1.11 2.00±1.313)4) 3.56±1.422)4) 4.02±1.302)4)電針組 10 1.05±1.14 2.03±1.42 1.86±1.311) 1.60±1.111)針刀組 10 1.07±1.09 2.02±1.22 1.90±1.211) 1.47±1.091)

2.2 各組大鼠下丘腦中CCK-8含量比較

表2顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠下丘腦中CCK-8含量明顯上升(P＜0.01);電針組、針刀組CCK-8含量有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與模型組相比，假手術(shù)組、電針組、針刀組下丘腦中CCK-8含量明顯降低(P＜0.01);與電針組相比，模型組CCK-8含量明顯上升(P＜0.05);針刀組、假手術(shù)組含量降低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠下丘腦中CCK-8含量比較 (±s，pmol/g)

表2 各組大鼠下丘腦中CCK-8含量比較 (±s，pmol/g)

注:與模型組比較1)P＜0.01，2)P＜0.05;與假手術(shù)組比較3)P＜0.01;與電針組比較4)P＜0.01，5)P＜0.05

組別 n CCK-8含量假手術(shù)組 10 90.03±16.791)5)模型組 10 129.79±29.253)4)電針組 10 115.57±12.782)針刀組 10 99.91±11.921)5)

2.3 各組大鼠血漿CCK-8含量比較(表3)

表3 各組大鼠血漿CCK-8含量比較 (±s，pg/mL)

表3 各組大鼠血漿CCK-8含量比較 (±s，pg/mL)

注:與模型組比較1)P＜0.01，2)P＜0.05;與假手術(shù)組比較3)P＜0.01;與電針組比較4)P＜0.01

組別 n CCK-8含量假手術(shù)組 10 261.19±59.341)模型組 10 511.42±109.783)4)電針組 10 328.91±68.682)針刀組 10 301.56±60.932)

表3顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿CCK-8含量明顯上升(P＜0.01);電針組、針刀組CCK-8含量有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與模型組相比，假手術(shù)組、電針組、針刀組血漿中CCK-8含量有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與電針組相比，模型組CCK-8含量明顯上升(P＜0.05);針刀組、假手術(shù)組含量變化不明顯(P＞0.05)。

2.4 各組大鼠下丘腦及血漿中5-HT含量比較

表4顯示，與假手術(shù)組相比，模型組下丘腦及血漿中5-HT含量明顯降低(P＜0.01);電針組、針刀組5-HT含量有所上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與模型組相比，假手術(shù)組、電針組、針刀組下丘腦及血漿中5-HT含量明顯上升(P＜0.01);與電針組相比，模型組下丘腦及血漿中5-HT含量明顯降低(P＜0.05);針刀組、假手術(shù)組含量較高(P＜0.05)。

表4 各組大鼠下丘腦及血漿中5-HT含量比較 (±s)

表4 各組大鼠下丘腦及血漿中5-HT含量比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.01，2)P＜0.05;與假手術(shù)組比較3)P＜0.01;與電針組比較4)P＜0.01，5)P＜0.05

組別 n 下丘腦(pmol/g) 血漿(pg/mL)假手術(shù)組 10 0.71±0.101)5) 4.12±0.831)5)模型組 10 0.42±0.023)4) 2.23±0.193)4)電針組 10 0.56±0.202) 3.13±0.522)針刀組 10 0.70±0.021)5) 3.87±0.461)5)

3 討論

針刀松解作為一種治療慢性軟組織損傷的有效手段，將傳統(tǒng)針灸方法與西醫(yī)外科手術(shù)刀相結(jié)合，能夠松解粘連、刮除瘢痕、消除痙攣，恢復(fù)軟組織的動態(tài)力學(xué)平衡。而電針則是對傳統(tǒng)針灸學(xué)的繼承與發(fā)揚，它結(jié)合了針與電兩種刺激手段，能夠有效提高臨床療效，且可以較為準(zhǔn)確地掌握刺激參數(shù)，并代替了手法運針，節(jié)省人力，故目前也廣泛地應(yīng)用于針灸治療中[6]。本實驗將這兩種較為有效的治療手段進(jìn)行對比，具有較高的臨床價值與意義。

膽囊收縮素(CCK)作為目前典型的腦腸肽與免疫調(diào)節(jié)肽之一，本身存在很多形式的分子結(jié)構(gòu)，而八肽膽囊收縮素(CCK-8)作為體內(nèi)含量最高的一種膽囊收縮素，是目前已知的最小分子形式的膽囊收縮素，且具備了全部生物活性[7-8]。在生物體內(nèi)，CCK-8通過旁分泌、內(nèi)分泌、自分泌等各種形式作用在靶細(xì)胞處，與其受體CCK1或者CCK2相結(jié)合，介導(dǎo)著相關(guān)的適應(yīng)性細(xì)胞，并保護(hù)著機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9]。根據(jù)目前有關(guān)的科研報道，CCK-8可以有效調(diào)節(jié)各組織免疫細(xì)胞的增殖、趨化、粘附及免疫殺傷作用，目前認(rèn)為CCK-8的調(diào)節(jié)作用主要存在兩種途徑，一為腦組織分泌的 CCK-8的中樞效應(yīng)，二為腹迷走神經(jīng)傳入纖維所介導(dǎo)的外周 CCK-8的作用機制[10-14]。依據(jù)本次實驗結(jié)果分析，模型組大鼠下丘腦及血漿中CCK-8的含量與假手術(shù)組相比明顯上升，這表明CCK-8作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，反應(yīng)著機體對于疼痛程度的敏感性，在中樞或外周鎮(zhèn)痛的研究中均起著極具代表性的作用;當(dāng)腰椎間盤突出癥產(chǎn)生疼痛與神經(jīng)損傷時，CCK-8的含量會明顯上升，而電針或者針刀的刺激，能夠使 CCK-8的含量有所下降，這提示，下丘腦和血漿中CCK-8含量的降低很可能是電針或者針刀鎮(zhèn)痛的機制之一。

5-HT，又稱為血清素，是一種自體活性物質(zhì)，大約90%的該物質(zhì)合成并分布在腸嗜鉻細(xì)胞中，一般與 ATP等成分共同儲存在細(xì)胞顆粒之中[15]。5-HT作為目前周知的神經(jīng)遞質(zhì)之一，集中分布在機體內(nèi)的松果體與下丘腦等組織中，而于腦內(nèi)組織中，又集中存在于下丘腦視交叉上核(SCN)[16-18]。研究表明，該物質(zhì)可能與機體對于痛覺的感受、睡眠的調(diào)節(jié)、體溫的穩(wěn)定等功能密切相關(guān)。外周組織中的5-HT是強血管收縮劑與平滑肌收縮刺激劑的一種，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的5-HT則是一種鎮(zhèn)痛物質(zhì)。在各種刺激的作用中，5-HT調(diào)控著脊髓水平下行的傷害性刺激，并進(jìn)一步通過 5-HT受體(5-HT1，5-HT2，5-HT3，5-HT4，5-HT5，5-HT6，5-HT7) 的作用，激動或拮抗機體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而延緩或者阻斷傷害性沖動的傳導(dǎo)，以降低機體對于疼痛性等各種傷害性刺激的反應(yīng)性與敏感性[19-22]。依據(jù)實驗結(jié)果分析，模型組下丘腦及血漿中5-HT濃度明顯低于假手術(shù)組，有極顯著性差異，這說明模型鼠因為髓核發(fā)生的炎癥反應(yīng)使得機體釋放的5-HT受體明顯增加，這些受體與5-HT相結(jié)合，使得作用在機體的神經(jīng)末梢上的鎮(zhèn)痛物質(zhì)減少，從而造成了機體產(chǎn)生痛覺過敏與痛反應(yīng);而在針刀或者電針的治療之后，下丘腦與血漿中5-HT的含量均有了明顯的上升，與模型組相比，具有顯著性差異，這說明針刀、電針這兩種治療手段都可以增加中樞與外周5-HT的釋放，從而抑制疼痛的發(fā)生。

本實驗提示針刀松解、電針治療對LDH根性神經(jīng)痛有明顯的鎮(zhèn)痛作用，而CCK-8與5-HT作為機體內(nèi)較為敏感的生物活性物質(zhì)與神經(jīng)遞質(zhì)，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的應(yīng)答，是鑒定這兩種治療方法是否有效的依據(jù)之一[23]。針刀松解治療LDH根性神經(jīng)痛在產(chǎn)生局部松解作用的基礎(chǔ)之上，直接刺激神經(jīng)根，誘發(fā)需經(jīng)CCK-8或5-HT誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，從而激發(fā)體內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)，從神經(jīng)、體液、免疫 3個方面共同作用，減輕疼痛刺激，緩解不良反應(yīng)[24-27]。而電針則是以神經(jīng)電生理、疼痛物質(zhì)變化為切入點進(jìn)行治療。通過本次實驗，對于針刀治療LDH的作用機制進(jìn)行了探索，為更深入地研究 LDH的發(fā)病機制及其病理轉(zhuǎn)變提供了有效的實驗依據(jù)，為針刀治療該病提供了實驗參考，為臨床治療該病擴展了思路。