帕提曼·肖開(kāi)提，穆巴熱科·吾普爾，劉 陽(yáng)，王新玲

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

薔薇紅景天 Rhodiola rosea L.為景天科 Crassulaceae紅景天屬 Rhodiola L.多年生草本植物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有90種紅景天屬植物，我國(guó)目前有73種，多分布于東北、甘肅、四川、云南、貴州、新疆等地區(qū)[1]?！缎陆幱弥参镏尽酚涊d，新疆薔薇紅景天主要分布于天山山脈海拔1 600～2 700 m的高寒地區(qū)[2]。紅景天屬植物的主要成分有紅景天苷、苷元酪醇、黃酮類、沒(méi)食子酸與苷、草質(zhì)素及其苷類。其中，紅景天黃酮類化合物具有抗病毒、抗腫瘤、強(qiáng)心、降壓、降低膽固醇、止咳祛痰、保肝等作用[3]。黃酮類化合物是植物中含量最豐富的一類，迄今已在植物中鑒定出數(shù)千種黃酮類化合物。隨著關(guān)于黃酮類化合物對(duì)人類健康有益認(rèn)識(shí)的加深，富含黃酮類化合物植物的提純?cè)絹?lái)越受到關(guān)注，且黃酮類成分已在抗炎、抗腫瘤、抗高血壓與心血管疾病等方面取得了一定的研究成果[4]。本研究中通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面分析法，以提取物中總黃酮含量為考察指標(biāo)，對(duì)新疆薔薇紅景天總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究；在已確定的提取工藝基礎(chǔ)上，通過(guò)篩選，應(yīng)用HPD-600型大孔吸附樹(shù)脂來(lái)純化薔薇紅景天總黃酮，并通過(guò)Design-Expert 8.06軟件，優(yōu)化工藝條件，為新疆薔薇紅景天資源的開(kāi)發(fā)利用和后期研究提供科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司，東京理化器械株獨(dú)資工廠）；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司，功率為150 W，頻率為 50 Hz）；New classic MF型電子天平（Mettler Toledo公司，精度為萬(wàn)分之一）；T6型新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HY-5型回旋振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

試藥：薔薇紅景天購(gòu)于新疆伊犁，品種由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定為正品，標(biāo)本保留在新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥／生藥教研室；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-200707）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮含量測(cè)定(硝酸鋁-亞硝酸鈉法)[5]

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL的溶液，即得。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

取蘆丁對(duì)照品5.72 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中溶解，精密吸取1 mL，蘆丁溶液置10 mL容量瓶中；加 5%亞硝酸鈉溶液 0.4 mL，搖勻，放置 6 min，加10% 硝酸鋁溶液 0.4 mL，搖勻，放置 6 min，加 4% 氫氧化鈉溶液4 mL，再加70%乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，在200～800 nm波長(zhǎng)區(qū)間掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選用510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 薔薇紅景天總黃酮制備及含量測(cè)定

取2.0 g薔薇紅景天藥材粉末，精密稱定，按提取條件加熱回流提取一定時(shí)間后，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮至10 mL容量瓶中，作為待測(cè)溶液。取薔薇紅景天總黃酮提取物適量，依法操作，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的黃酮含量。

2.1.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液1.5 mL，置10 mL容量瓶中，按擬訂方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果的 RSD為0.22%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取紅景天總黃酮提取物19.56 mg，精確稱定，置10 mL容量瓶中，按擬訂方法分別于0，15，30，45，60，90，120 min 時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD 為1.91%(n＝6)，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取紅景天總黃酮提取物共6份，精密稱定，平行制備 6份提取液，各0.5 mL，置 10 mL容量瓶中，按擬訂方法測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD為0.86%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取已知含量（5.108 4 mg／mL）的薔薇紅景天粉末9份，各1 g，制備供試品溶液，再分別精確加入蘆丁對(duì)照品，混勻，按擬訂方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得回收率為 100.58% ，RSD 為 1.97% （n＝9），表明方法穩(wěn)定可行。詳見(jiàn)表1。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素考察

提取溶劑體積分?jǐn)?shù)：取薔薇紅景天藥材粉末1 g，精密稱定，加入20 mL不同體積分?jǐn)?shù)的10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇，加熱回流提取1 h，過(guò)濾并濃縮，低溫干燥，按擬訂方法測(cè)定提取物中黃酮含量 。結(jié)果測(cè)得含量依次為 16.73%，33.51%，38.00% ，46.25% ，39.26% ，故選擇 70% 乙醇為最佳提取溶劑體積分?jǐn)?shù)。

表1薔薇紅景天總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

提取時(shí)間：取薔薇紅景天藥材粉末1 g，精密稱定，加入 20 mL 70% 乙醇，加熱回流提取 30，60，90，120，150 min，過(guò)濾并濃縮，低溫干燥，按擬訂方法測(cè)定提取物中黃酮含量。結(jié)果測(cè)得含量依次為 36.14%，41.25% ，39.38% ，39.20% ，41.96% ，考慮到周期問(wèn)題，故初步確定最佳提取時(shí)間為60 min。

物料比：取薔薇紅景天藥材粉末1 g，精密稱定，分別按 1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50，1 ∶60，1 ∶70 的物料比加入70%乙醇，加熱回流提取，將提取液過(guò)濾并濃縮，低溫干燥，取濾液按擬訂方法測(cè)定提取物中黃酮含量。結(jié)果測(cè)得含量依次為 35.36% ，36.68% ，36.86% ，43.82% ，42.49% ，41.95% ，40.54% ，故選擇物料比為1 ∶40。

提取次數(shù)：取薔薇紅景天藥材粉末1 g，精密稱定，用已篩選的提取溶劑濃度、提取時(shí)間、物料比分別提取1，2，3次，將提取液過(guò)濾濃縮，低溫干燥，按擬訂方法測(cè)定提取物中的黃酮含量。結(jié)果測(cè)得含量依次為 39.16%，42.85%，39.66%，故初步確定提取次數(shù)為2次。

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)2次，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）和物料比（因素C）為自變量，以薔薇紅景天提取物總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值，利用 Design-Expert 8.06 軟件中的Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表3。

方差分析：試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。數(shù)據(jù)采用 Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行多元模擬擬合分析，得到以薔薇紅景天提取物中黃酮含量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程Y＝53.47+2.05A+1.96B+0.73C+2.09AB-2.19AC+1.39 BC-4.45 A2-4.36 B2-1.78 C2?；貧w方程方差分析見(jiàn)表 4?？梢?jiàn)，響應(yīng)面模型 F值為 7.02，P＜0.01回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)為 0.689 5，P＞0.05表示不顯著，表明此模型以實(shí)際情況擬合很好。R2＝0.900 2，Radj2＝0.771 9，Rp2＝0.438 4，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值間具有高度相關(guān)性，模型方程能很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。由表3可見(jiàn)，該模型中一次項(xiàng)A和B對(duì)該模型的影響顯著（P ＜0.05）；二次項(xiàng)中，A2和 B2對(duì)模型的影響極顯著（P ＜0.01）；交互項(xiàng) AB，AC、BC 無(wú)顯著性。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)薔薇紅景天總黃酮提取物含量的影響顯著，但各因素間無(wú)影響。由響應(yīng)面結(jié)果得到各因素對(duì)總黃酮提取物含量的影響大小依次為因素A＞因素B＞因素C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞物料比。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)因素與水平

表3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)方差分析結(jié)果

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)提取物中總黃酮含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與物料比對(duì)提取物中總黃酮含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖3 提取時(shí)間與物料比對(duì)提取物中總黃酮含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

響應(yīng)面分析：圖1至圖3可直觀反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖1可見(jiàn)，A，B，C 3因素交互作用顯著。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取物中黃酮含量隨之增加，隨后黃酮含量有下降趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%和提取時(shí)間為60 min時(shí)，其值最大。響應(yīng)面的坡度較陡，等高線為橢圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用較強(qiáng)，對(duì)提取物中黃酮含量的影響較大；乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面相對(duì)于提取時(shí)間較陡，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物中黃酮含量的影響比提取時(shí)間大（因素A＞因素B）；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到一定程度后，其增加趨勢(shì)不太明顯，其中物料比的變化對(duì)提取物中黃酮含量的影響對(duì)于其他因素最小?？梢?jiàn)，對(duì)黃酮含量的影響顯著程度為因素A＞因素B＞因素C，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到最佳提取工藝為：溶劑體積分?jǐn)?shù)69.89%，提取時(shí)間58.08 min，料液比 1∶40，提取物中總黃酮含量的理論值為56.15%。根據(jù)實(shí)際情況確定最佳提取工藝條件為70%乙醇、提取 60 min、物料比(1∶40)。在此條件下，取3份藥材，精密稱定，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定薔薇紅景天提取物中黃酮的含量。結(jié)果3批樣品中總黃酮含量分別為56.38% ，57.70% ，56.82% ，平均含量為 56.97% ， RSD為1.18%，表明優(yōu)化提取工藝穩(wěn)定、可控。

2.3 純化工藝篩選

2.3.1 樹(shù)脂型號(hào)篩選

預(yù)處理與再生：將大孔樹(shù)脂用無(wú)水乙醇充分浸泡24 h，用蒸餾水淋洗至流出液與水（1∶5）混合無(wú)渾濁為止，再用5%鹽酸浸泡4～6 h，用水洗至中性，最后用5%氫氧化鈉溶液浸泡4～6 h，用水洗至中性，備用[6]。

靜態(tài)吸附與靜態(tài)解吸考察：取預(yù)處理好的6種大孔吸附樹(shù)脂各1 g，精密稱定，置50 mL具塞三角瓶中，加入總黃酮粗提物制備的溶液20 mL（總黃酮質(zhì)量濃度為5.230 8 mg ／mL），密閉，室溫回旋振蕩吸附（每分鐘 120次）24 h，充分吸附后，過(guò)濾，吸取濾液按含量測(cè)定方法測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算不同大孔樹(shù)脂的吸附量和吸附率；將吸附飽和的樹(shù)脂晾干后，加入20 mL 70%乙醇，回旋振蕩（每分鐘120次）24 h解吸附，過(guò)濾，吸取濾液按含量測(cè)定方法測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算不同樹(shù)脂的解吸附量和解吸附率。

2.3.2 大孔吸附樹(shù)脂類型確定

根據(jù)靜態(tài)吸附、解吸的考察，計(jì)算6種樹(shù)脂的吸附量、吸附率、解吸量與解吸率，詳見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，HPD600型樹(shù)脂對(duì)薔薇紅景天總黃酮的指標(biāo)均較其余5種好，故確定用HPD600型大孔吸附樹(shù)脂為理想樹(shù)脂。

表5 6種樹(shù)脂的性質(zhì)、吸附量、吸附率及解吸率

2.4 純化工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素考察

總黃酮上樣液質(zhì)量濃度：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。用蒸餾水沖洗樹(shù)脂除去水溶性雜質(zhì)，確保樹(shù)脂被沖洗干凈且無(wú)氣泡，取6.071 2 mg／mL的總黃酮粗提液，加水稀釋至0.514 0，1.032 1，1.517 8，2.003 5，2.489 2，3.035 6，3.521 3 mg／mL，按2 BV個(gè)表現(xiàn)體積(1 BV為 1個(gè)樹(shù)脂床體積)，以1 mL／min的流速上樣，收集流出液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂吸附量和吸附率。當(dāng)質(zhì)量濃度為 2.003 5 mg／mL時(shí)吸附率最高，可達(dá)86.14%，故上樣質(zhì)量濃度選擇 2.003 5 mg／mL 。

進(jìn)樣流速：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。將質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL、體積為2 BV 的總黃酮粗提液，以 0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL ／min流速進(jìn)行進(jìn)樣，收集流出液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂吸附量和吸附率。初步確定進(jìn)樣流速為1.5 mL ／min 。

樣品溶液體積：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。將質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL的總黃酮粗提液，選擇不同體積（1，2，3，4，5，6 VB），以最佳流速1.5 mL／min進(jìn)樣，收集流出液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂吸附量和吸附率。當(dāng)上樣體積為2 BV時(shí)，吸附率最高。故選擇2 BV為進(jìn)樣體積。

上樣液pH：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。取6份質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL的紅景天總黃酮粗提液15 mL，分別調(diào)節(jié)其pH為3，4，5，6，7，8，以 2 BV 柱床體積，1.5 mL ／min 的流速進(jìn)樣，收集流出液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂吸附量。結(jié)果選擇pH＝4為上樣pH。

洗脫液體積分?jǐn)?shù)：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。將質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL、體積為2 BV的總黃酮粗提液以最佳流速1.5 mL／min進(jìn)樣，進(jìn)行樹(shù)脂吸附，先水洗之無(wú)色（棄去水洗部分），再分別用50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇以1.5 BV的柱床體積，1 mL／min的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂解附量和解吸率。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到90%時(shí)，洗脫率最高可達(dá)62.2%。故選用90%乙醇進(jìn)行洗脫。

洗脫液體積：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。將質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL的總黃酮粗提液、以2 BV柱床體積、1.5 mL／min的流速進(jìn)樣，進(jìn)行樹(shù)脂吸附，再用 90% 乙醇以 1，1.5，2，2.5，3，3.5 BV的柱床體積、1 mL／min的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂解吸量和解吸率。當(dāng)洗脫液用量達(dá)2BV時(shí)，洗脫率最高可達(dá)61.73%，解吸效果最好。故洗脫液的洗脫用量選擇2 BV。

洗脫速度：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5 g HPD600型大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱。將質(zhì)量濃度為2.0035 mg／mL的總黃酮粗提液，以 2 BV柱床體積、1.5 mL／min流速進(jìn)樣，進(jìn)行樹(shù)脂吸附，再分別用 2 BV柱床體積的90%乙醇溶液，以 1，2，3，4 mL ／min 的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算樹(shù)脂解吸量和解吸率。洗脫流速為2 mL／min時(shí)洗脫效果最好，洗脫率可達(dá)63.87%。故洗脫流速選擇2 mL／min。

2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6 軟件，以上樣液質(zhì)量濃度（因素A）、洗脫液體積分?jǐn)?shù)（因素B）、洗脫液體積（因素C）為自變量，以純度為響應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

表6 響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝試驗(yàn)因素與水平

表7 響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析：通過(guò)軟件對(duì)表7的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到純度（Y）與各水平間的二次多項(xiàng)式方程Y＝81.14+2.65 A+4.08 B+0.37 C+2.16 AB-1.95 AC-0.30 BC-11.00 A2-6.90 B2-15.04 C2。為解釋回歸方程的有效性和各因素對(duì)純度的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8?？梢?jiàn)，該回歸模型是極顯著的（P ＜ 0.01）。回歸模型的決定系數(shù)(R2)＝0.972 4，校正決定系數(shù)(Radj2)＝0.936 9，Rp2＝0.640 5。失擬項(xiàng)（P ＝0.640 5＞0.05）不顯著，表明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度高，誤差小。故可用該模型分析紅景天總黃酮的提純效果。由表7可見(jiàn)，該模型中一次項(xiàng)因素A、因素B對(duì)該模型的影響顯著（P＜0.05），其中因素 B為極顯著。二次項(xiàng)中 A2，B2，C2對(duì)模型的影響極顯著（P ＜0.01）；交互項(xiàng)AB，AC，BC無(wú)顯著性。表明上樣液質(zhì)量濃度、洗脫液體積分?jǐn)?shù)及洗脫液體積對(duì)薔薇紅景天總黃酮純度的影響顯著，但各因素間無(wú)影響。由響應(yīng)面分析結(jié)果得各因素對(duì)總黃酮純度的影響大小依次為因素B＞因素A＞因素C，即洗脫液體積分?jǐn)?shù)＞上樣液質(zhì)量濃度＞洗脫液體積。

表8 優(yōu)化純化工藝回歸方程分析結(jié)果

響應(yīng)面分析：由圖4至圖6可見(jiàn)，隨上樣液質(zhì)量濃度和洗脫液體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮純度先增加后減少，當(dāng)洗脫液體積為90%、上樣液質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL時(shí)，達(dá)到最大值；響應(yīng)面的坡度較陡，等高線為橢圓形，表明上樣液質(zhì)量濃度與洗脫液體積分?jǐn)?shù)交互作用較強(qiáng)，對(duì)總黃酮純度的影響較大；總黃酮純度隨著上樣液質(zhì)量濃度和洗脫液濃度的增加先增加后減少，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.003 5 mg／mL、洗脫液體積為2 BV時(shí)，總黃酮純度達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)；響應(yīng)面的坡度較陡，等高線為圓形，表明上樣液質(zhì)量濃度與洗脫液體積交互作用較弱，對(duì)總黃酮純度的影響較??；當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)為90%、洗脫液體積為2 BV時(shí)總黃酮純度達(dá)到響應(yīng)面最高點(diǎn)；響應(yīng)面的坡度平緩，等高線為橢圓形，表明洗脫液體積分?jǐn)?shù)與洗脫液體積交互作用較弱；故由響應(yīng)面圖可見(jiàn)，洗脫液體積分?jǐn)?shù)（因素B）對(duì)純度的影響最顯著，其次是上樣液質(zhì)量濃度（因素A），影響較小的是洗脫液體積（因素C），與方差分析結(jié)果相符。

2.4.3 最佳條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到的最佳純化工藝為：上樣質(zhì)量濃度1.92 mg／mL，洗脫液體積分?jǐn)?shù)89.99%、洗脫液體積 2.16 BV，純度理論值為81.99%?？紤]實(shí)際情況，最后確定紅景天總黃酮純化工藝條件為：洗脫液體積2 BV，上樣液質(zhì)量濃度2.003 5 mg／mL，洗脫液體積分?jǐn)?shù) 90%。在此工藝條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果3批次紅景天總黃酮純度分別為 82.18%，83.60%，82.72%，平均 82.83%，RSD為0.87（n＝3），表明利用此方法純化總黃酮有現(xiàn)實(shí)意義。

圖4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)與上樣液濃度對(duì)總黃酮純度影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖5 洗脫液體積與上樣液濃度對(duì)總黃酮純度影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖6 洗脫液體積與洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮純度影響的響應(yīng)面及等高線

3 討論

響應(yīng)面法具有檢測(cè)精確度高、可靠、試驗(yàn)所需次數(shù)少、能反映因素和預(yù)測(cè)值之間關(guān)系等優(yōu)點(diǎn)，因此近幾年來(lái)，其在中藥提取及純化中得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。

近20年來(lái)，吸附性大孔樹(shù)脂的快速發(fā)展使得其用途不斷擴(kuò)大，主要應(yīng)用于糖的精制、氣體吸附、藥理活性天然產(chǎn)物的分離和富集，以及其他生物制品的純化。使用大孔樹(shù)脂的吸附過(guò)程由于其獨(dú)特的吸附性能和其他優(yōu)點(diǎn)而引起了關(guān)注[9]。

本試驗(yàn)中用單因素試驗(yàn)對(duì)影響薔薇紅景天總黃酮提取物含量的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、物料比等因素進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其對(duì)薔薇紅景天總黃酮提取物含量具有顯著影響。在此基礎(chǔ)上，再利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)薔薇紅景天總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得最優(yōu)提取工藝條件為：70%乙醇，提取60 min，物料比1∶40；在此條件下，薔薇紅景天總黃酮提取物中的平均含量為56.97%，與理論預(yù)測(cè)值相符。

建立一種高效的大孔樹(shù)脂吸附對(duì)紅景天提取物中總黃酮的分離純化方法。對(duì)6種大孔樹(shù)脂（NKA-9，AB-8，D101，HPD100，HPD500，HPD600）進(jìn)行了比較和評(píng)價(jià)，HPD600型在所測(cè)試的樹(shù)脂中表現(xiàn)出最好的吸附容量和解吸率，故選擇HPD600型。通過(guò)單因素試驗(yàn)控制不同變量，初步得出上樣液質(zhì)量濃度、上樣液體積、洗脫液體積分?jǐn)?shù)、洗脫液體積分?jǐn)?shù)、pH、上樣流速、洗脫流速的適宜范圍，通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化，最終得到最佳純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度2.003 5 mg／mL、洗脫液體積分?jǐn)?shù)90%，洗脫液體積為2 BV；此條件下，純化后總黃酮平均純度為82.83%。通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅景天總黃酮提取及純化工藝，建立可靠的二次回歸模型，對(duì)于紅景天總黃酮的提取、純化有一定的參考意義。