沈 晗 ，黃玉宇 ， ，陳 汀 ，沈夕坤

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009）

茵陳蒿湯源于《傷寒論》，由茵陳、梔子和大黃組方，常用于治療濕熱黃疸。方中茵陳苦寒，降泄、清肝膽濕熱，為君藥；梔子性寒，清三焦之火，為臣藥；大黃瀉熱通利，為佐藥[1]。三藥共用，通利二便，使黃疸漸消。茵陳中的綠原酸等成分及梔子中的梔子苷均有保肝利膽作用[2-5]；大黃中的大黃酸、大黃素等成分可作用于消化系統(tǒng)，對(duì)胰腺和肝臟有保護(hù)和修復(fù)作用。茵陳蒿湯具有利膽、護(hù)肝等作用，對(duì)于急性黃疸型肝炎、膽囊炎、膽石癥等療效良好[6-9]。茵陳蒿湯療效的顯著與否除與藥材質(zhì)量有關(guān)外，其煎煮工藝也有影響。本研究中以浸泡時(shí)間、加水量和煎煮時(shí)間為影響因素，以浸膏得率和藥材主要成分的含量為衡量指標(biāo)探討茵陳蒿湯的水煎煮工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AG285型電子分析天平（精度為萬分之一），AX26DR型電子天平（精度為百分之一），均購自瑞典梅特勒-托利多公司；KQ-300VDB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，雙頻為 45 Hz／80 Hz）；KDC-140R 型超速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Direct-Q3UV型超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)為 110753-201415，純度為96.2% ），梔子苷（批號(hào)為 07499605），蘆薈大黃素（批號(hào)為 110795-201710，純度為 98.3% ），大黃酸（批號(hào)為110757-200206），大黃素（批號(hào)為 1110756-200110），大黃酚（批號(hào)為 110796-201319，純度為 99.6%），大黃素甲醚（批號(hào)為 110758-201616，純度為 99.0%），咖啡酸（批號(hào)為 110885-201703，純度為 99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)為4974，純度為 98.0%），異綠原酸 B（批號(hào)為 3089，純度為 98%），均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；茵陳（批號(hào)為190216，產(chǎn)地為江蘇），梔子（批號(hào)為 181113），均購自蘇州市天靈飲片公司；大黃（批號(hào)為190517，產(chǎn)地為甘肅，蘇州市博源藥業(yè)有限公司)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按處方比例，稱取5劑藥材，置不銹鋼鍋中煎煮，煎煮2次，煎煮液濃縮至300 mL。以浸泡時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）、煎煮時(shí)間（因素C）和空白項(xiàng)（因素D）為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.2 浸膏得率測(cè)定

取表1因素水平下制備的9份濃縮液50 mL，置已干燥至恒重的陶瓷蒸發(fā)皿中，于99.9℃水浴鍋上蒸干，再置105℃烘箱中干燥3 h后取出，放入干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

2.3 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A） -0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫 (程序見表 2)；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254，327 nm；進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.3.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取梔子苷、新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為 0.494 0，0.365 2，0.175 0，0.032 9，0.260 6，0.011 3，0.002 7，0.364 6，0.005 2，0.006 8 mg／mL 的混合溶液，即得。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

供試品溶液：取2.1項(xiàng)下制備的茵陳蒿湯水煎液9份，每份10 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入甲醇14 mL，超聲處理30 min，取出冷卻，加甲醇定容至刻度，離心，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得，編號(hào)為 S1～S9。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：將2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋成不同梯度的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣5 μL，以溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：依法取同一混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為1.18% ，0.50% ，1.15% ，0.65% ，1.13% ，0.22% ，0.86% ，2.30% ，3.90% ，2.70%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：依法平行制備6份S9供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為 0.59%，0.60% ， 0.53% ，0.28% ，1.73% ，0.38% ，2.14% ，2.30%，3.64%，1.49%(n ＝ 6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：依法制備 S9供試品溶液，于 0，3，6，9，16，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為0.70% ， 0.62% ，1.30% ，0.22% ，1.34% ，0.30% ，0.93% ，2.47% ，2.32% ，1.43%(n ＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：依法平行制備6份S9供試品溶液，每份1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入等體積的混合對(duì)照品溶液，加甲醇定容至刻度。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 多指標(biāo)成分加權(quán)分析

將總體設(shè)置為100分，由于茵陳和梔子在茵陳蒿湯中比例較高，故將新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B和梔子苷的含量權(quán)重系數(shù)均設(shè)置為10分；由于大黃素甲醚成分含量較少，大黃素甲醚在酸性或加熱條件下易發(fā)生水解而轉(zhuǎn)化成大黃素[10]。故將游離蒽醌類成分作為一個(gè)總體，其含有量權(quán)重系數(shù)設(shè)置為20分；由于浸膏代表整個(gè)方劑，將其權(quán)重系數(shù)設(shè)為30分。綜合評(píng)分 ＝10.0×新綠原酸含量／最大值+10.0×綠原酸含量／最大值+10.0×咖啡酸含量／最大值+10.0×異綠原酸B含量／最大值+10.0×梔子苷含量／最大值+20.0×總游離蒽醌含量／最大值+30.0×浸膏得率／最大值。結(jié)果見表5，方差分析見表6?？梢?，各因素對(duì)浸出物和指標(biāo)性成分的影響度依次為A＞B＞C，即浸泡時(shí)間＞加水量＞煎煮時(shí)間；浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)果影響最大，這可能是因?yàn)橐痍愘|(zhì)地輕浮，易漂浮在水面，不易被水浸潤(rùn)；又由于質(zhì)地較疏松，有效成分會(huì)被快速煎出。故茵陳蒿湯的煎煮工藝確定為A3B3C2，即加18倍量水浸泡50 min后煎煮30 min。

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

按最佳煎煮工藝，同時(shí)煎煮3批茵陳蒿湯，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果3批茵陳蒿湯的綜合評(píng)分分別為98.51，98.63，97.71分，平均為98.28分?？梢娫摷逯蠊に囂崛÷矢?，且穩(wěn)定可行。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n＝9)

表6 方差分析

3 討論

參照2015年版《中國藥典(一部)》給定的波長(zhǎng)（梔子為 238 nm[11]248，大黃為 254 nm[11]23，茵陳為 327 nm[11]239）并結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器的全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在238 nm波長(zhǎng)下出峰多，梔子苷含量高，但所測(cè)成分分離度不好，且咖啡酸成分在此波長(zhǎng)下檢測(cè)不到；254 nm波長(zhǎng)下，所測(cè)得大黃各成分分離度較好，且含量較高，梔子苷在此波長(zhǎng)下含量也較高，且分離度較好，但咖啡酸含量檢測(cè)不到；327 nm波長(zhǎng)下，新綠原酸、綠原酸、咖啡酸和異綠原酸B各成分含量高、分離度好、峰形好，但其他待測(cè)成分幾乎檢測(cè)不到。故選取254 nm和327 nm雙波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過正交試驗(yàn)，最終確定了茵陳蒿湯的最佳水煎煮工藝，為茵陳蒿湯的煎煮提供了標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量保障。此外，還發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯加水量比一般方劑要多，這可能是因茵陳吸水系數(shù)較大，故對(duì)于含有草藥類的方劑應(yīng)酌情添加水量。

中藥湯劑是中醫(yī)治療疾病的傳統(tǒng)劑型，是中醫(yī)臨床應(yīng)用最廣泛的劑型，也是制備其他劑型的基礎(chǔ)。湯劑煎煮的好壞會(huì)直接影響疾病治療效果，故應(yīng)嚴(yán)格把控中藥湯劑的煎煮工藝，在遵循相關(guān)煎煮規(guī)范的同時(shí)，應(yīng)根據(jù)方劑中藥材的質(zhì)地來確定其煎煮因素，并形成各自的煎煮規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。