譚章斌，丁文俊，徐由財(cái)，劉彬

肝癌是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其中在亞洲地區(qū)發(fā)病率與死亡率最高[1-2]。盡管在肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療方面取得了進(jìn)步，但總體預(yù)后仍不理想，由于術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，肝癌患者的5年生存期仍為20%～30%[3-4]。因此，繼續(xù)尋找防治肝癌的有效藥物將有助于改善肝癌的治療。中草藥已有數(shù)千年應(yīng)用歷史，由于其低毒性和良好的臨床療效，被認(rèn)為是開發(fā)抗惡性腫瘤的最有希望的替代/補(bǔ)充藥物之一[5]。茵陳蒿湯是臨床常用的中藥經(jīng)方，據(jù)報(bào)道有抗肝癌作用[6]。然而，其抗肝癌作用的分子機(jī)制尚未完全了解。JAK2/STAT3信號(hào)通路激活對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)至關(guān)重要，但包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中JAK2/ STAT3呈異常激活，驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等多種生理學(xué)行為[7]。本研究探討了茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用以及對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素、PBS緩沖液從美國(guó)Gibco公司購(gòu)買。c-Myc(#18583，E5Q6W)、Bcl-XL(#2764，54H6)、p-JAK2(#4406，D15E2)、JAK2(#3230，D2E12)、STAT3(#30835，D1B2J)、GAPDH(#5174，D16H11)一抗從美國(guó)CST公司購(gòu)買，p-STAT3(ab76315，EP2147Y)、Cyclin D1(ab134175，EPR2241)以及Mcl-1(ab243136，19C4-15)一抗從美國(guó)Abcam公司購(gòu)買。 CCK-8、鈣黃綠素/PI染色試劑盒從日本東仁有限公司購(gòu)買。EdU染色試劑盒從廣州銳博公司購(gòu)買。

1.2 茵陳蒿湯制備

茵陳蒿、梔子、大黃提取物購(gòu)買自西安開來(lái)有限公司，該公司已參照《中國(guó)藥典》對(duì)所生產(chǎn)的中藥提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。生藥 ∶提取物比例為10 ∶1，按照茵陳 ∶梔子 ∶大黃=3 ∶2 ∶1比例混合，使用雙蒸水溶解三種中藥提取物，過(guò)濾備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2人肝癌細(xì)胞系從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的DMEM中，并在37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 CCK-8檢測(cè)肝癌細(xì)胞活力

將HepG2細(xì)胞(1×104/孔)接種在96 孔板，每組五個(gè)復(fù)孔，第2天加入10、20、30、40、50、60、80 μg/mL 茵陳蒿湯，在 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，然后加入20 μL的CCK-8。吸光度通過(guò)微孔板酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量。采用SPSS 19.0軟件計(jì)算IC50。

1.5 EdU染色檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力

將HepG2細(xì)胞(1×104/孔)接種在96 孔板中培養(yǎng)，分為對(duì)照組和12.5、25、50 μg/mL茵陳蒿湯組(茵陳蒿湯給藥濃度根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行設(shè)置)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，按如下步驟依次進(jìn)行：EdU標(biāo)記細(xì)胞、固定細(xì)胞、Apollo染色、DNA染色，最后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。EdU陽(yáng)性百分比= EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 鈣黃綠素/PI染色觀察肝癌細(xì)胞存活

將HepG2細(xì)胞(1×104/孔)接種在96 孔板，分組同1.5，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明，棄原培養(yǎng)基，加入鈣黃綠素/PI混合液繼續(xù)培養(yǎng)30 min，隨后熒光顯微鏡觀察拍照。

1.7 Western blot檢測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

分組同1.5，干預(yù)24 h后每組細(xì)胞用PBS洗滌三次，用含有蛋白酶與磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液收集裂解細(xì)胞，然后12 000 rpm離心15 min。將收集的蛋白定量，每組取20 μg的蛋白質(zhì)通過(guò)10%的SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)移到聚乙烯氟化物膜(PVDF膜)。封閉后，PVDF膜在4 ℃下用p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Cyclin D1、c-Myc、Mcl-1、Bcl-XL(1∶1 000)和GAPDH(1∶3 000)的一抗孵育過(guò)夜。接著采用與HRP結(jié)合的二抗孵育膜，最后使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 茵陳蒿湯抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖

為了觀察茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，在HepG2細(xì)胞上進(jìn)行了CCK-8測(cè)定。結(jié)果如圖1A所示，茵陳蒿湯以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞活性，24 h茵陳蒿湯處理的 IC50值為55.40 μg/mL。本研究進(jìn)行EdU染色以進(jìn)一步確認(rèn)茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果見圖1B-C、表1，經(jīng)過(guò)茵陳蒿湯處理后，肝癌細(xì)胞增殖數(shù)顯著減少, 隨著劑量的增加，細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步降低。12.5、25和50 μg/mL茵陳蒿湯組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為15.10%、11.80%和5.56%，顯著低于對(duì)照組的37.60%(P<0.05)。

2.2 茵陳蒿湯促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞死亡

為了探索茵陳蒿湯抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了鈣黃綠素/PI染色。綠色熒光為活細(xì)胞，紅色熒光為死亡細(xì)胞。結(jié)果見圖2、表2，茵陳蒿湯處理24 h后，活細(xì)胞數(shù)顯著減少，死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。茵陳蒿湯以劑量依賴性的方式促進(jìn)了HepG2肝癌細(xì)胞的死亡。12.5、25和50 μg/mL茵陳蒿湯組處理后的肝癌細(xì)胞死亡率分別為10.41%、12.60和21.06%，顯著高于對(duì)照組的1.43%(P<0.05)。茵陳蒿湯通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞死亡從而抑制肝癌增殖與生長(zhǎng)。

圖1 茵陳蒿湯抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖 A：CCK-8觀察茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響；B：EdU染色觀察12.5、25和50 μg/mL茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；C：EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例。與對(duì)照組相比，*P<0.05

表1 各組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例

2.3 茵陳蒿湯抑制肝癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活

為了觀察茵陳蒿湯抑制肝癌細(xì)胞增殖和存活的作用是否涉及JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，本研究分析了茵陳蒿湯處理后肝癌細(xì)胞中的p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3A、表3所示，茵陳蒿湯顯著抑制了JAK2和STAT3 的磷酸化水平，而總JAK2和STAT3蛋白表達(dá)沒有明顯變化(圖3)。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了STAT3信號(hào)通路下游細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、c-Myc以及抗凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1、Bcl-XL的表達(dá)。結(jié)果如圖3B、表4所示，茵陳蒿湯濃度依賴性地抑制肝癌細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc、Mcl-1以及Bcl-XL的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，茵陳蒿湯通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞中的JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抑制肝癌作用。

表2 各組細(xì)胞死亡率

圖2 茵陳蒿湯促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞死亡 A：12.5、25和50 μg/mL茵陳蒿湯處理24 h后，活/死肝癌細(xì)胞染色圖；B：死亡肝癌細(xì)胞比值。與對(duì)照組相比，*P<0.05

圖3 茵陳蒿湯抑制肝癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活和下游增殖、抗凋亡相關(guān)靶蛋白的表達(dá)水平

表3 各組細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表4 各組細(xì)胞JAK2/STAT3下游增殖與抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

多年來(lái)臨床實(shí)踐與現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中藥復(fù)方或中成藥制劑具有良好的抗肝癌作用[8-10]。茵陳蒿湯最早記載于張仲景《傷寒論》中，千百年來(lái)常被應(yīng)用于治療濕熱黃疸，近現(xiàn)代醫(yī)家廣泛地將其應(yīng)用于治療肝膽疾病[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯具有保肝、抗肝纖維化、增強(qiáng)免疫以及抗腫瘤等作用[12-14]。華永慶等[15]通過(guò)細(xì)胞固相色譜法探索茵陳蒿湯內(nèi)有效活性成分的抗肝癌作用，發(fā)現(xiàn)4-羥基-3, 5-二牻牛兒基-苯丙烯酸等成分能夠抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖，可能是茵陳蒿湯抑制肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。李木松等[16]發(fā)現(xiàn)加味茵陳蒿湯能夠通過(guò)激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制HepG2肝癌細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯能抑制肝癌細(xì)胞活性，促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞死亡從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。結(jié)合既往的臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯有保護(hù)肝和抗肝纖維化作用，本文認(rèn)為茵陳蒿湯在治療肝癌方面有效且安全，有可能被開發(fā)為一種新的肝癌預(yù)防/治療中藥治療劑。

JAK2屬于Janus激酶(JAKs)家族成員之一，是一類細(xì)胞內(nèi)非受體蛋白酪氨酸激酶[17]。JAK2是多種細(xì)胞因子或激素信號(hào)的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能被包括干擾素、生長(zhǎng)激素、白介素-6和瘦素在內(nèi)的多種細(xì)胞因子受體激活，幾乎在每一種細(xì)胞類型中表達(dá)[18]。STAT3是JAK2的下游底物，JAK2激酶的激活會(huì)導(dǎo)致STAT3蛋白在C-終端域磷酸化從而激活STAT3，活化的STAT3可以將信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)傳輸?shù)郊?xì)胞核，并參與關(guān)鍵細(xì)胞功能的基因轉(zhuǎn)錄，以調(diào)節(jié)幾個(gè)關(guān)鍵功能，如細(xì)胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移和分化等[19]。異常激活的JAK2/STAT3在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中被檢測(cè)，驅(qū)動(dòng)多種腫瘤細(xì)胞惡性生理功能[20]。因此，JAK2/STAT3信號(hào)通路被認(rèn)為是肝癌治療的潛在作用靶點(diǎn)之一。使用小分子抑制劑抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活可以誘發(fā)凋亡，抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)[21]。茵陳蒿湯中的多種有效成分具有抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的作用。研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿的有效成分茵陳色原酮通過(guò)抑制STAT3 激活抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[22]。大黃的有效活性成分大黃素能夠通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)[23]。梔子的有效活性成分綠原酸能夠通過(guò)抑制JAK2/STAT3激活，抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥[24]。本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯作用24 h后，HepG2肝癌細(xì)胞內(nèi)p-JAK2和p-STAT3水平顯著下降。異常激活的STAT3會(huì)引起增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、c-Myc的持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)。Bcl-XL和Mcl-1是由STAT3調(diào)控轉(zhuǎn)錄的兩種抗凋亡蛋白，其過(guò)度表達(dá)可以抑制肝癌進(jìn)展期間的凋亡[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在HepG2肝癌細(xì)胞中，茵陳蒿湯下調(diào)了Cyclin D1、c-Myc以及Bcl-XL、Mcl-1蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，茵陳蒿湯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、存活的抑制作用是通過(guò)抑制STAT3，靶向抑制STAT3下游Cyclin D1、c-Myc和Bcl-XL、Mcl-1的表達(dá)而發(fā)揮的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活，以及下游增殖和抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗肝癌作用。茵陳蒿湯可以開發(fā)成為一種安全有效的預(yù)防/治療肝癌中藥治療劑。