陳 靜，高 瑜，夏海建，黃富宏，王蓓蓓

（揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 揚(yáng)州 225001）

精神分裂癥是由一組癥狀群所組成的臨床綜合征，其破壞性嚴(yán)重[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸，尤其是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）系統(tǒng)功能低下是精神分裂癥的病因之一[2]。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿的全草，是一種補(bǔ)益中藥。淫羊藿苷是其主要活性成分，可改善NMDA系統(tǒng)功能低下的精神分裂癥動(dòng)物的異常行為[3]。但淫羊藿苷調(diào)節(jié)NMDA系統(tǒng)的分子機(jī)制未見報(bào)道。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是由BDNF基因編碼在腦內(nèi)合成的一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用。BDNF基因也是精神分裂癥致病基因之一，主要表現(xiàn)精神分裂癥患者體內(nèi)BDNF的表達(dá)發(fā)生異常[4-6]。以淫羊藿為主藥的中藥方劑可治療精神分裂癥，并調(diào)節(jié)海馬體內(nèi)BDNF的表達(dá)[7-10]。同時(shí)，淫羊藿苷對中樞神經(jīng)中BDNF mRNA的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[11]。BDNF可通過自分泌，與細(xì)胞膜上的TrkB受體結(jié)合，并激活TrkB受體。激活的TrkB受體可活化下游蛋白磷脂酶 Cγ（PLCγ）[12]；激活的 PLCγ使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解產(chǎn)生二酰甘油（DAG），DAG 進(jìn)一步激活蛋白激酶 Cδ（PKCδ）；PKCδ 通過活化 Ras蛋白激活Raf-1，進(jìn)一步激活其下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPKK或MEK）及胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）。而ERK的激活可上調(diào)NMDA受體NR1亞基的活性[13]。本研究中應(yīng)用NMDA受體拮抗劑MK-801構(gòu)建精神分裂癥動(dòng)物模型[14]，探討了淫羊藿苷對BDNF／TrkB介導(dǎo)的PKC／Raf-1／ERK信號通路的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CM1950型冰凍切片機(jī)（德國 Leica Biosystems公司）。

試藥：MK-801（M107），5% 小牛血清蛋白（BSA，批號為 B2064），利培酮(批號為 PHR1631)，均購自美國Sigma-Aldrich 公司；anti-BDNF（批號為 ab108319），anti-TrkB（批 號 為 ab18987），anti-Raf-1（批 號 為ab137435），anti-NMDA NR1（批號為 ab109182），均購自英國 Abcam 公司；anti-PKCδ（批號為＃2058），Anti-ERK1 ／2（批號為＃4696），β -actin（批號為＃3700，1 ∶5 000），均購自美國 Cell Signal公司；NP40 裂解液（碧云天生物技術(shù)公司，批號為P0013F）；SDS-PAGE電泳凝膠（批號為 1656020），PVDF 膜（批號為 1620177），均購自美國Bio-Rad公司；淫羊藿苷（南京本草益康生物科技有限公司）[11]。

動(dòng)物：SPF級健康雄性SD大鼠24只，4周齡，體質(zhì)量90～110 g，購自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0044，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證書編號為2150541。

1.2 方法

精神分裂癥模型的構(gòu)建：采用MK-801制備精神分裂癥動(dòng)物模型。選取大鼠24只，清潔飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在 21～24℃，12 h 晝夜節(jié)律（8：00～20：00），自由進(jìn)食和飲水。將MK-801溶于生理鹽水中，腹腔注射，每日1次，劑量為0.2 mg／kg；空白對照組注射生理鹽水；所有動(dòng)物接受連續(xù)2周的MK-801或生理鹽水注射。

實(shí)驗(yàn)分組與給藥：MK-801處理后，動(dòng)物行為異常（尤其是認(rèn)知障礙和空間記憶障礙）可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月[15]，故MK-801動(dòng)物模型構(gòu)建完成后，對大鼠使用藥物。將MK-801處理的大鼠隨機(jī)分為模型組、藥物組（淫羊藿苷組）和陽性對照組（利培酮組），每組6只。將相應(yīng)藥物混入糖丸（含玉米粉40%、白砂糖40%、全脂奶粉18%、明膠2%），喂飼大鼠，1日3次，每8 h 1次。對照組喂飼不含藥物的糖丸；模型組喂飼不含藥物的糖丸；藥物組喂飼含淫羊藿苷[30 mg／(kg·d）][11]的糖丸；陽性對照組喂飼含利培酮[0.3 mg／(kg·d）]的糖丸。連續(xù)喂飼1周。

蛋白質(zhì)印跡(WB)法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)：采用冰凍切片法切取大鼠海馬體組織，在冰凍切片機(jī)上切成500 μm厚度的切片，再對照腦圖譜[16]切取海馬體。加入含蛋白酶抑制劑的NP40裂解液勻漿腦組織。勻漿后的組織加熱變性，以每孔 10 μg蛋白上樣，進(jìn)行 SDSPAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%小牛血清蛋白（BSA）于室溫封閉1 h。再加入相應(yīng)抗體，于4℃孵育，過夜。采用Bio-Rad Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保重復(fù)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 X±SE表示，采用 SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，利用Kolmogorov-Smirnov Z-test檢測數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則利用單因素方差分析（One-way ANOVA）及 Dunnett t檢驗(yàn)比較組間差異；若數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，則使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whiney U檢驗(yàn)比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對海馬體中NMDA NR1亞體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果見圖1。MK-801模型組中，NMDA NR1亞體的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；藥物處理后，與模型組相比，MK-801導(dǎo)致的NMDA NR1亞體的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），使其恢復(fù)至正常水平，且其效果接近利培酮（P ＜0.05）。

圖1 淫羊藿苷對NMDA受體NR1亞基表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

2.2 對海馬體中BDNF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果見圖2。MK-801處理2周后可顯著降低海馬體中 BDNF的表達(dá)水平（P＜0.01）；與模型組相比，藥物處理后淫羊藿苷可顯著提升被MK-801下調(diào)的BDNF的表達(dá)水平（P＜0.05），使其恢復(fù)至接近正常水平，其效果與利培酮相似。

2.3 對海馬體中TrkB受體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

TrkB受體是BDNF的主要作用受體。由圖3可見，TrkB受體的表達(dá)水平在MK-801處理2周后顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷可顯著提升被MK-801下調(diào)的TrkB受體的表達(dá)水平（P＜0.05），使其恢復(fù)至接近接近正常水平，其效果與利培酮相似。

2.4 對海馬體中PKC表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果見圖4。MK-801可顯著下調(diào)PKC的表達(dá)水平（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷可顯著上調(diào)被MK-801下調(diào)的PKC表達(dá)水平（P＜0.05），其效果與利培酮相似。

圖2 淫羊藿苷對BDNF表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

圖3 淫羊藿苷對TrkB受體表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

2.5 對海馬體中Raf-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果見圖5。MK-801可顯著下調(diào)Raf-1的表達(dá)水平（P＜0.01）。與模型組相比，藥物處理后，淫羊藿苷雖上調(diào)了Raf-1的表達(dá)水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.068）；而利培酮可顯著提升Raf-1的表達(dá)水平（P＜0.05）。

2.6 對海馬體中ERK1／2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果見圖6?？梢姡琈K-801可顯著下調(diào)ERK的表達(dá)水平（P＜0.01）。藥物處理后，與模型組相比，藥物組的ERK表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），使其恢復(fù)至接近正常水平，其效果與利培酮相似。

圖4 淫羊藿苷對PKC表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

圖5 淫羊藿苷對Raf-1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

3 討論

谷氨酸受體功能低下被認(rèn)為是精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制之一。MK-801作為NMDA受體的非競爭性拮抗劑，能通過降低腦內(nèi)NMDA受體功能引起類似精神分裂癥的癥狀，在嚙齒類動(dòng)物中引起一系列復(fù)雜的行為學(xué)改變，常作為篩選抗精神分裂癥潛在藥物的經(jīng)典動(dòng)物模型[2]。本研究中應(yīng)用MK-801腹腔給藥處理未成年大鼠，阻斷其腦內(nèi)NMDA受體，從而破壞大鼠腦部NMDA系統(tǒng)的發(fā)育，致使動(dòng)物成年后出現(xiàn)NMDA受體功能低下導(dǎo)致的相關(guān)癥狀，如認(rèn)知障礙和空間記憶障礙[14]。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷可上調(diào)海馬體中NMDA受體NR1亞體的表達(dá)水平，從分子層面證實(shí)淫羊藿苷可增強(qiáng)NMDA受體的功能。

抗精神病藥物可通過BDNF介導(dǎo)的通路調(diào)節(jié)NMDA受體的功能。TrkB受體是BDNF的主要功能受體，表達(dá)在細(xì)胞膜上，BDNF可通過自分泌，與TrkB受體結(jié)合并使其活化，而PKC，Raf-1，ERK是TrkB受體下游信號通路之一，其蛋白表達(dá)水平與TrkB受體表達(dá)相關(guān)。

圖6 淫羊藿苷對ERK1／2表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷可上調(diào)被MK-801抑制的TrkB受體的表達(dá)水平，可能是由于其上調(diào)了BDNF的表達(dá)，致使TrkB受體的表達(dá)水平上升；可改善被MK-801下調(diào)的BDNF的表達(dá)水平，其很有可能通過BDNF介導(dǎo)的通路調(diào)節(jié)NMDA受體功能；PKC，Raf-1，ERK的表達(dá)水平均受到抑制，但淫羊藿苷可顯著提升這些蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，淫羊藿苷很有可能通過激活BDNF／TrkB介導(dǎo)PKC／Raf-1／ERK信號通路增進(jìn)NMDA受體的功能，進(jìn)而治療NMDA受體功能低下導(dǎo)致的精神分裂癥。

本研究中，采用抗精神病藥物利培酮作為陽性對照。結(jié)果顯示，淫羊藿苷的療效接近利培酮，且調(diào)節(jié)NMDA受體的分子機(jī)制與利培酮相似，提示其在精神分裂癥治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有抗精神病藥物都具有毒副作用（如錐體外系反應(yīng)），也未見患者長期使用淫羊藿苷有明顯的毒副作用；相反，淫羊藿苷和現(xiàn)有抗精神病藥物聯(lián)用可改善患者的生活質(zhì)量[7]，故淫羊藿苷很有可能成為現(xiàn)有抗精神病藥物的優(yōu)良替代品，但仍需進(jìn)一步探索淫羊藿苷對多種不同精神分裂癥的治療效果。但由于本研究屬中短期實(shí)驗(yàn)，淫羊藿苷的毒副作用可能尚未表現(xiàn)出來，后續(xù)研究中應(yīng)對比現(xiàn)有抗精神病藥物，系統(tǒng)研究長期使用淫羊藿苷可能引起的毒副作用；且淫羊藿苷是否還通過其他信號通路調(diào)節(jié)NMDA受體也有待進(jìn)一步研究。