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鹽酸戊乙奎醚誘導(dǎo)早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1的表達(dá)及其對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用

2020-06-17 09:38胡婷婷史惠卿劉小娟
中國(guó)藥業(yè) 2020年11期
關(guān)鍵詞:平滑肌鹽酸試劑盒

陳 曦,胡婷婷,史惠卿,劉小娟,李 楠

(中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,四川 成都 610083)

早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白 1(EGR1)屬即刻早期基因家族、編碼cys2-his2型鋅指蛋白,廣泛表達(dá)于從酵母到人類的真核細(xì)胞中[1]。作為轉(zhuǎn)錄因子的EGR1,能與多種下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合,調(diào)控許多基因的表達(dá),這些基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、缺氧反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)[2-3],有的甚至在腫瘤中發(fā)揮重要作用[4-5]。EGR1是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)介導(dǎo)的腦室區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞在缺氧-低血糖恢復(fù)期擴(kuò)增的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。DICKINSON等[7]的研究顯示,EGR1能促進(jìn)血管表皮細(xì)胞的增殖,但EGR1通過(guò)何種基因影響細(xì)胞的增殖仍有待進(jìn)一步研究。本研究中探討了EGR1在人類血管平滑肌細(xì)胞(CRL-1999)增殖過(guò)程中的作用及影響的下游基因,旨在揭示其在肺血管損傷修復(fù)中的作用提供參考?,F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

細(xì)胞株:CRL-1999購(gòu)于ATCC。

試劑:F-12K營(yíng)養(yǎng)混合物培養(yǎng)基,胎牛血清,均購(gòu)自Gibco公司;抗人EGR1抗體(Santa公司);抗人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D1(CCND1)抗體,抗人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2(ERK1/2)抗體,抗人磷酸化的 ERK1/2(p-ERK1/2)抗體,均購(gòu)自 CST公司;辣根氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔,山羊抗鼠二抗,均購(gòu)自博奧生物公司);RIPA裂解液;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒,5% ~20%梯度預(yù)制膠,電泳液,轉(zhuǎn)膜液及蛋白彩色預(yù)染MARKER、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,均購(gòu)自碧云天公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRTPCR)試劑盒,均購(gòu)自日本Takara公司;慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P生物公司;EDU檢測(cè)試劑盒(iClickTM EdU Andy Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit,廣東復(fù)能基因有限公司)。

儀器:7500型 Real-Time PCR System PCR儀(美國(guó)ABI公司);Fluor Chem型凝膠成像化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)Protein Simple公司);Gallios型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng):取CRL-1999細(xì)胞,置含10%胎牛血清的F-12K營(yíng)養(yǎng)混合物培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞慢病毒干擾實(shí)驗(yàn):取10×104個(gè)/孔對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,置12孔板中,過(guò)夜貼壁培養(yǎng)。按感染復(fù)數(shù)(MOI)為30的量加入慢病毒,培養(yǎng)12 h后,換成新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h,然后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

qRT-PCR:采用Trizol法分別提取siEGR1-CRL-1999細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用SYBR PCR試劑盒在7500型Real-Time PCR System RCR儀上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)(預(yù)變性,95 ℃ 30 s,然后 95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40 個(gè)循環(huán)),設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。PCR引物:ACTIN,正向引物 5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′,反向引物 5′-GTAGTTTC GTGGATGCCACAG-3′;EGR1,正向引物 5′-CAGCAC CTTCAACCCTCAG-3′,反向引物 5′-CACAAGGTGTT GCCACTGTT-3′;CCND1,正向引物 5′-TATTGCGCTGCTACCGTTGA-3′,反向引物 5′-CCAATAGCAGCAA ACAATGTGAAA-3′。

蛋白質(zhì)印跡(WB)法檢測(cè) EGR1,CCND1,ERK1 /2和p-ERK1/2蛋白表達(dá):采用RIPA裂解液法提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測(cè)蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液后,沸水煮5 min使蛋白變性;蛋白上樣量為40 μg,以5%~20% 梯度膠電泳分離蛋白質(zhì);濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏乙烯(PVDF)膜,5%BSA封閉1 h,加入一抗4℃過(guò)夜(EGR1 1 ∶1 000,ACTIN 1 ∶2 000,CCND1 1 ∶1 000,ERK1 /2 1 ∶1 000,p-ERK1 /2 1 ∶1 000),二抗室溫孵育 1 h(山羊抗鼠 1∶5 000,山羊抗兔 1∶5 000),采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

EDU法檢測(cè)細(xì)胞增殖:分別用胰酶消化對(duì)照組細(xì)胞和 siEGR1-CRL-1999細(xì)胞,計(jì)數(shù),2×105個(gè) /孔接種于6孔板內(nèi),37℃過(guò)夜培養(yǎng),棄培養(yǎng)基,每孔加入2 mL含 10 μmol/mL EDU 的培養(yǎng)液,37 ℃,CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h,按試劑盒說(shuō)明處理細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀分析。

鹽酸戊乙奎醚處理細(xì)胞:將CRL-1999細(xì)胞和siEGR1-CRL-1999細(xì)胞按 5×105個(gè)/孔接種于 6孔板中,培養(yǎng)過(guò)夜,然后加入鹽酸戊乙奎醚,并設(shè)空白對(duì)照組,最終質(zhì)量濃度為2 μg/mL。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并于0,0.5,1,2,4,8 h 時(shí)取材備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料(正態(tài)分布)以±s表示,組內(nèi)兩兩比較行 t檢驗(yàn);采用相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析,r<0.3為低度正相關(guān),0.3≤r<0.7 為中度正相關(guān),0.7≤ r< 1.0 為高度正相關(guān);統(tǒng)計(jì)圖表采用GraphPad Prism 6繪制。P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒對(duì)CRL-1999細(xì)胞中EGR1表達(dá)水平的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGR1干擾慢病毒48 h后,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),大部分細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的綠色熒光(見(jiàn)圖1 A),表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染了慢病毒,并整合到基因組上,成功構(gòu)建siEGR1-CRL-1999細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示,EGR1被成功干擾(見(jiàn)圖 1 B,P <0.01)。同時(shí),WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EGR1蛋白表達(dá)水平也明顯降低(見(jiàn)圖1 C)。

圖1 慢病毒對(duì)CRL-1999細(xì)胞中EGR1表達(dá)水平的影響

2.2 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CRL-1999細(xì)胞增殖的影響

將EDU加入siEGR1-CRL-1999細(xì)胞或?qū)φ战M細(xì)胞中,培養(yǎng)6 h后,陰性對(duì)照組中26%的細(xì)胞含有EDU,即26%的細(xì)胞進(jìn)入了S期;同時(shí),siEGR1-CRL-1999細(xì)胞中只有19%的細(xì)胞含有EDU,其增殖效率減少了 27% (見(jiàn)圖 2,P < 0.01)。表明干擾 EGR1 后,CRL-1999細(xì)胞增殖受到了明顯抑制。

圖2 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CRL-1999細(xì)胞增殖的影響

2.3 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CCND1表達(dá)水平的影響

敲低 EGR1后,qRT-PCR結(jié)果表明,CCND1的表達(dá)相應(yīng)降低(見(jiàn)圖 3A,***P =0.0003,**P =0.001 1)。WB實(shí)驗(yàn)也表明,敲低CRL-1999細(xì)胞的EGR1后,CCND1蛋白表達(dá)水平明顯降低(見(jiàn)圖3 B)。

圖3 敲低EGR1表達(dá)對(duì)CCND1表達(dá)水平的影響

2.4 鹽酸戊乙奎醚對(duì)EGR1表達(dá)水平的影響

對(duì)CRL-1999細(xì)胞進(jìn)行鹽酸戊乙奎醚處理,分別在 0 h(處理前),及處理后 0.5,1,2,4,8 h 時(shí)提取蛋白質(zhì),進(jìn)行WB檢測(cè),發(fā)現(xiàn)處理1 h后EGR1蛋白表達(dá)開(kāi)始增多,2 h時(shí)達(dá)頂點(diǎn),一直持續(xù)到8 h時(shí)(見(jiàn)圖4 A),表明鹽酸戊乙奎醚能誘導(dǎo)CRL-1999細(xì)胞的EGR1表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,對(duì)siEGR1-CRL-1999細(xì)胞和CRL-1999細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行鹽酸戊乙奎醚處理,并進(jìn)行WB檢測(cè)。處理4 h后,鹽酸戊乙奎醚處理組的CRL-1999細(xì)胞和 siEGR1-CRL-1999 細(xì)胞的(b,d)EGR1 蛋白表達(dá)量均比未處理組(a,c)增多,且藥物誘導(dǎo)后的siEGR1-CRL-1999細(xì)胞(d)的EGR1蛋白表達(dá)量顯著低于CRL-1999細(xì)胞(b),進(jìn)一步表明鹽酸戊乙奎醚能誘導(dǎo)CRL-1999細(xì)胞的EGR1表達(dá)(見(jiàn)圖4 B)。

圖4 鹽酸戊乙奎醚對(duì)EGR1表達(dá)水平的影響

2.5 鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)ERK1/2通路刺激EGR1表達(dá)

對(duì)2.4項(xiàng)下不同時(shí)間點(diǎn)提取的蛋白質(zhì)中p-ERK1/2,ERK1/2和EGR1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,p-ERK1/2在鹽酸戊乙奎醚處理1 h后表達(dá)水平達(dá)峰值,維持至2 h時(shí),隨后逐漸減少。而EGR1的表達(dá)在1 h時(shí)僅輕微增多,后逐漸增多,其蛋白水平表達(dá)變化在時(shí)間上總落后于 p-ERK1/2(見(jiàn)圖5),提示鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)ERK1/2通路誘導(dǎo)EGR1的表達(dá)。

圖5 加入鹽酸戊乙奎醚后,不同時(shí)間點(diǎn)p-ERK1/2,EGR1蛋白表達(dá)水平

3 討論

通常血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈中膜中維持非增殖狀態(tài),但在損傷或其他刺激下,中膜的血管平滑肌細(xì)胞會(huì)遷移到內(nèi)膜,開(kāi)始增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜擴(kuò)張,即新內(nèi)膜形成[8]。富含絲/精氨酸剪輯因子1(SRSF1)能通過(guò) Δ133p53-EGR1復(fù)合體,影響KLF5的表達(dá),從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖[9]。XIE等[10]的研究發(fā)現(xiàn),EGR-1參與了瘦素誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)的減少和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。SYSOL等[11]的研究發(fā)現(xiàn),血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)通過(guò) EGR-1 誘導(dǎo)鞘氨醇激酶 1(SphK1)的表達(dá),可促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。此外,在其他組織中,EGR1也起到了促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,如肌肉衍生的衛(wèi)星細(xì)胞[12]、小鼠肝臟細(xì)胞[13]等。EGR1除了能被生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)高表達(dá)外,也能被一些刺激誘導(dǎo)高表達(dá),如缺氧、輻照等;缺氧情況下,會(huì)對(duì)肺動(dòng)脈造成一定程度損傷,故進(jìn)一步研究EGR1的功能,不但能在損傷修復(fù)階段起作用,而且在損傷防治階段也能起到一定作用。

阿魏酸通過(guò)缺氧上調(diào)EGR1來(lái)改善人肌腱衍生干細(xì)胞的自我更新和分化[14]。CHEN等[15]的研究結(jié)果證實(shí),CCND1的轉(zhuǎn)錄是由EGR1直接調(diào)控的,CCND1是3種非連接蛋白(Cyclin D1,D2,D3)之一,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中主要調(diào)控G1期向S期過(guò)渡。敲低CRL-1999細(xì)胞的EGR1后,會(huì)影響CCND1的表達(dá),從而影響人血管平滑肌細(xì)胞CRL-1999的體外增殖。

鹽酸戊乙奎醚是我國(guó)自主研發(fā)的抗膽堿Ⅰ類新藥,有較強(qiáng)的抗M和N樣受體作用,對(duì)外周神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M樣作用和一定程度的抗N樣作用,臨床主要用于對(duì)抗有機(jī)磷的中毒和全身麻醉患者術(shù)前給藥。鹽酸戊乙奎醚能較早改善氧合,減緩急性肺損傷的進(jìn)展,可應(yīng)用于對(duì)創(chuàng)傷性急性肺損傷早期的干預(yù)治療[16]。鹽酸戊乙奎醚能抑制炎性反應(yīng),減輕肺組織的損傷,改善氧合,能有效緩解多發(fā)傷導(dǎo)致的急性肺損傷[17],但其具體作用機(jī)制和通路仍不清楚。ZHANG等[18]的研究認(rèn)為,在缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷中,通過(guò)適當(dāng)增加自噬可起到保護(hù)作用,同時(shí) ERK1/2信號(hào)通路具有積極的調(diào)節(jié)作用。ERK1/2是20世紀(jì)80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,是MAPK家族的一個(gè)重要亞族,正常定位于胞漿,當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性,產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)鹽酸戊乙奎醚能通過(guò)ERK1/2通路刺激EGR1的表達(dá),但鹽酸戊乙奎醚通過(guò)EGR1影響血管平滑肌細(xì)胞的具體作用機(jī)制仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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