張粟斌，雷 培，王子越，林可心，代靖嬈，段澤浩，孟凡娟

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

巨柏Cupressusgigantea為柏科Cupressaceae柏木屬Cupressus常綠喬木，又名雅魯藏布江柏木，為西藏特有的珍稀樹種，同時(shí)也是西藏特有的古樹，壽命可達(dá)千年，材質(zhì)優(yōu)良，而且具有生態(tài)環(huán)境保護(hù)功能，是當(dāng)?shù)刂匾脑炝?、水土保持以及用材樹種[1-4]。由于巨柏種群分布較為狹窄，天然更新困難，加之自然死亡以及人工砍伐等諸多因素的干擾，導(dǎo)致巨柏群體數(shù)量急劇減少，已成為我國瀕危物種[5-6]。因此，了解巨柏遺傳多樣性特性，明確這個(gè)古老樹種的遺傳特性，對于揭示西藏巨柏的起源、保護(hù)和利用均具有重要意義。

葉綠體DNA(cpDNA)在多數(shù)被子植物中屬母系遺傳[7]，其中非編碼區(qū)變異豐富，對其進(jìn)行測序分析可以廣泛用于樹木的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等研究[8-9]。此外，cpDNA用于樹木起源與演化、種質(zhì)資源保護(hù)等方面也較多[10-12]。本研究通過對67份西藏巨柏個(gè)體的葉綠體3個(gè)非編碼區(qū)進(jìn)行測序分析，明確西藏巨柏樹種的起源與演化，從而為西藏巨柏種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為雅魯藏布江沿岸的巨柏種子，源自8個(gè)巨柏居群，共計(jì)67個(gè)個(gè)體，樣品取樣地信息見表1。將種子播種，獲得的苗木葉片，直接進(jìn)行凍存，存入-80 ℃超低溫冰箱，以備后期葉片的總DNA提取。

表1 8個(gè)居群的樣本信息

1.2 總DNA提取

采用改良后的CTAB法[10]提取巨柏葉片DNA，隨后分別使用紫外光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度和純度，取達(dá)到要求的DNA稀釋至20 ng·μL-1，保存在-20 ℃冰箱用于PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增和測序

通過查閱文獻(xiàn)，本研究選擇適合種內(nèi)差異水平的 10 對非編碼區(qū)的cpDNA通用引物(P02、CP12、CP15、18S、trnL-trnF、nadh K/C、matK、rbaL、rps4、trnQ-trnG)進(jìn)行葉綠體PCR引物的初篩。所有PCR引物均由上海生物工程公司合成(表2)。

表2 試驗(yàn)采用cpDNA的引物信息

本試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的優(yōu)化體系為：DNA模板2.5 μL、引物0.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、最后加入12.8 μL ddH2O，總體積為20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。選擇凝膠成像清晰單一條帶的PCR產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用DNAstar和MEGA5.0軟件對巨柏的葉綠體DNA測序片段進(jìn)行拼接分析；利用DnaSP軟件分析群體的單倍型多樣性；通過Network軟件構(gòu)建葉綠體DNA單倍型間的中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

通過對測序的序列進(jìn)行比對與對位排列后，CP12序列的長度為300 bp，CP15的序列長度為396 bp，18S的序列長度為1 000 bp。通過對3個(gè)序列的堿基分析發(fā)現(xiàn)：G/C含量豐富，在整個(gè)序列中所占比例為51.4%。圖1為CP12擴(kuò)增的所有樣品的圖譜。

2.2 單倍型特征

通過對3個(gè)序列進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)4個(gè)，占序列全長的1.9%，其中18S區(qū)域存在2個(gè)變異位點(diǎn)共4個(gè)單倍型，CP12存在1個(gè)變異位點(diǎn)2個(gè)單倍型，CP15存在1個(gè)變異位點(diǎn)2個(gè)單倍型，各變異位點(diǎn)見表3。

2.3 遺傳多樣性

從表4可以看出：18S區(qū)域的單倍型多態(tài)性數(shù)據(jù)較高，其中k、Pi和Hd分別為0.754、0.008 5和0.569；非編碼區(qū)CP12擁有較高的單倍型多樣性方差(0.003 65)及單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(0.060)。

注：M為DNA Marker DL2000；1-67分別為67份巨柏材料。

圖1 基于引物CP12的擴(kuò)增圖譜

利用T檢驗(yàn)法分析分離位點(diǎn)數(shù)目與核苷酸多樣性之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)：當(dāng)P<0.10時(shí)的D值均為正值，表示群體進(jìn)化符合中性進(jìn)化。T檢驗(yàn)在擴(kuò)增片段18S、CP12和CP15中均為正值(1.332 27、0.531 63和0.262 14)，合并片段的結(jié)果也為正值，為0.967 80，根據(jù)差異顯著性說明擴(kuò)增的3個(gè)葉綠體DNA片段均遵循中性進(jìn)化模型，進(jìn)化過程中未經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)。而且經(jīng)過合并后的片段T檢驗(yàn)結(jié)果也說明合并后的片段未經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)且遵循中性進(jìn)化模型(表4)。

對不同巨柏群體進(jìn)行AMOVA分析，群體間變異為14.2%，群體內(nèi)變異為85.8%，可見群體內(nèi)變異大，同時(shí)遺傳分化系數(shù)Fst=0.224 80(P<0.001)。

2.4 單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Network中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法和最大簡約法構(gòu)建巨柏不同居群的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖2)，共形成11個(gè)單倍型，其中出現(xiàn)頻率最高的是H_1，其次為H_6，然后是H_7。其中群體4、群體8、群體15、群體14、群體13、群體12、群體11等7個(gè)群體共享單倍型H_1。由圖2可以看出，單倍型3、單倍型4、單倍型9、單倍型11之間關(guān)系較近，但是單倍型分布概率較小，而且單倍型10和單倍型8與其它分支較遠(yuǎn)，說明由于長期進(jìn)化，不同群體逐漸朝不同方向發(fā)展，導(dǎo)致群體11和群體14進(jìn)化最遠(yuǎn)，而其它群體關(guān)系較近。

表4 葉綠體PCR片段多態(tài)性信息

注：H為單倍型數(shù)目；Vs為變異位點(diǎn)；Ps為簡約信息位點(diǎn)；k為核酸差異平均數(shù)；Pi為核酸多態(tài)性；Hd為單倍型多態(tài)性；Vh為單倍型多態(tài)性的變異；Sh為單倍型多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)變異。

3 討論與結(jié)論

利用大量的基因組遺傳多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，通常葉綠體基因組的進(jìn)化緩慢，且屬于單向傳遞、不存在基因交換等特征，因此被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析。這主要是因?yàn)閏pDNA作為細(xì)胞質(zhì)DNA，在進(jìn)化中不經(jīng)歷基因重組，導(dǎo)致受到的選擇壓力較小，可以反映植物在長期進(jìn)化過程中的遺傳與變異積累[15-16]。本研究針對8個(gè)群體進(jìn)行葉綠體DNA(cpDNA)的遺傳多樣性分析，cpDNA的遺傳多樣性水平(Hd)為0.689，說明巨柏的遺傳多樣性較為豐富，對環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，這與前人研究認(rèn)為巨柏群體屬于片段化的分布結(jié)果并不相同，而目前巨柏資源的衰退主要是諸多人為因素所導(dǎo)致的[17]。

圖2 基于葉綠體3種序列不同群體巨柏的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖

目前，主要采用葉綠體基因組的非編碼區(qū)進(jìn)行分析測定，如trnL-trnF、trnS-trnG和trnQ-trnG等，這主要是由于非編碼區(qū)較為保守，可以對物種進(jìn)行有效分析。但是在前期試驗(yàn)過程中，采用常用的葉綠體基因序列不能對巨柏進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增的多態(tài)性較小，因此，本研究所采用的序列并非常用的葉綠體基因序列，這可能是因?yàn)榫薨厥禽^古老的樹種，在基因組方面有其自身的特點(diǎn)，其原因還需要進(jìn)一步研究。

通常采用T檢驗(yàn)方法分析分離位點(diǎn)數(shù)目與核苷酸多樣性之間的關(guān)系。當(dāng)P<0.05或P<0.01的負(fù)D值說明群體進(jìn)化過程中經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)；當(dāng)P>0.05時(shí)正D值，表示群體進(jìn)化符合中性進(jìn)化[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)：巨柏群體的D值為正值，說明巨柏的進(jìn)化符合中性進(jìn)化。同時(shí)對巨柏群體進(jìn)行AMOVA分析，發(fā)現(xiàn)群體內(nèi)變異比例較大(85.8%)，個(gè)體的遺傳變異對巨柏總遺傳變異的貢獻(xiàn)較大，群體間的遺傳變異較小，也就是個(gè)體之間的遺傳差異較大，因此對巨柏群體進(jìn)行全面的個(gè)體保護(hù)措施，而不是采取群體保護(hù)措施。

綜上分析，利用葉綠體序列可以有效揭示巨柏遺傳多樣性水平。同時(shí)根據(jù)巨柏整體遺傳多樣性水平高、種群內(nèi)變異程度低的特點(diǎn)，采取對巨柏種子人工育苗等手段擴(kuò)大種群數(shù)量，增加群體的遺傳多樣性；同時(shí)提高當(dāng)?shù)厝嗣駥薨貫l危的認(rèn)識，避免過度的人為采伐等破壞措施，宜采用就地保存的方式加以保護(hù)。