紀(jì)純陽，楊成超，矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213)

全紅楊Populuseuramericanacv.‘quanhong’又稱中華全紅楊，是原中紅楊(P.euramericanacv.‘zhonghong’)二次芽變彩葉新品種[1]，是落葉喬木，喜溫，單葉互生，雌雄異株。該品種已經(jīng)通過了河南省林木新品種審(認(rèn))定，并已申請了國家植物新品種保護(hù)[2]。全紅楊整個生長期葉片都為紅色，葉脈和葉柄也呈紅色，光澤亮麗，色感極佳。全紅楊葉片大而厚，環(huán)保無飛絮，隔噪效果好，吸塵性強(qiáng)，觀賞價值極高，是彩葉類紅葉樹種中的佼佼者[3]。全紅楊屬高大彩葉喬木，適用性強(qiáng)，在城市道路和園林景觀綠化中被廣泛應(yīng)用，極具發(fā)展?jié)摿?，是其它彩葉樹種所無法比擬的。

20世紀(jì)60年代，國外開始進(jìn)行楊樹組織培養(yǎng)研究，我國于70年代開始研究。隨著楊樹組織培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，已被廣泛用于楊樹多個派別無性系組培快繁研究，我國學(xué)者對香楊[4]、大青楊[5]、歐美楊渤豐1號楊[6]、725楊[7]、山新楊[8]、小黑楊[9]、巨霸楊[10]、遼寧楊[11]、蓋楊[12]、歐美楊111號[13]等不同派別楊樹無性系進(jìn)行了大量試驗研究，建立了組織培養(yǎng)再生體系。近年來，許多學(xué)者對全紅楊葉色呈色機(jī)理、嫁接繁育、栽培技術(shù)等方面進(jìn)行研究，取得了很大成績。研究發(fā)現(xiàn)全紅楊存在返祖現(xiàn)象，返祖率達(dá)0.2%～0.3%，生長速度相對較慢[14]。目前未見全紅楊組織培養(yǎng)方面的報道。本文開展了全紅楊組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究，為建立全紅楊組織培養(yǎng)與快繁系統(tǒng)、選育楊樹良種、種質(zhì)資源保存、擴(kuò)大栽培與推廣等提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年7月，在蓋州市團(tuán)山鎮(zhèn)任屯村遼寧省楊樹研究所院內(nèi)試驗圃地，選擇1年生健壯無病蟲害的全紅楊扦插苗，從幼嫩葉片上剪取葉柄(稍帶葉片)。

1.2 試驗方法

1.2.1 研究材料預(yù)處理[12，15]

采回的葉柄用流動的自來水沖洗數(shù)次至干凈，在無菌室內(nèi)用75%酒精溶液沖洗3次后浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次，放入無菌超凈工作臺內(nèi)，用0.1%HgCl2浸泡6 min，不停地用無菌鑷子攪拌，最后用無菌水沖洗數(shù)次，用吸水濾紙吸干水分，將葉柄剪成1 cm左右的小段，其兩端用無菌剪刀剪掉，即獲得無菌外植體。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化[16-17]

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)和NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)，附加蔗糖25.0 g·L-1、瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0，將已滅菌的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每隔24 h觀察記錄愈傷組織的分化情況。每種培養(yǎng)基接種30個培養(yǎng)物，每個三角瓶接種3塊培養(yǎng)物。

1.2.3 不定芽分化培養(yǎng)基的優(yōu)化[18-19]

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)，附加蔗糖30.0 g·L-1、瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.5，將生成大塊愈傷組織的外植體用無菌剪刀剪成1 cm3的小塊，接種于培養(yǎng)基中，每隔48 h觀察記錄不定芽發(fā)育情況。每種培養(yǎng)基接種25塊愈傷組織，每個三角瓶接種5塊愈傷組織。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化[4，20]

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS和1/2MS，加入不同質(zhì)量濃度的IBA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)，附加蔗糖20.0 g·L-1、瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0，從分化培養(yǎng)基選取高2～3 cm的不定芽，沿不定芽基部剪下接種于生根培養(yǎng)基中，每隔24 h觀察記錄不定芽生根情況，計算平均生根數(shù)和生根率。每種培養(yǎng)基接種24個不定芽，每個三角瓶接種2～3塊培養(yǎng)物。

1.2.5 培養(yǎng)條件[21]

將接種后所有培養(yǎng)物置于恒溫有光照的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃，室內(nèi)光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，每天6：00-20：00進(jìn)行光照。

1.2.6 生根組培苗栽培[11，22]

待苗高5 cm以上時，選擇根系發(fā)達(dá)、長勢好的生根苗進(jìn)行容器移栽。待生根苗高20～30 cm時，移栽到試驗育苗地。育苗地選擇土壤肥力好、疏松、排水良好，易于灌溉的壤土或沙壤土。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

7 d后葉柄兩端剪切口處開始膨大，葉柄逐漸膨脹伸長，10 d后葉柄表面形成紅褐色的愈傷組織，隨后愈傷組織不斷增殖，體積逐漸膨大，呈紅褐色。從表1可以看出，分化葉柄數(shù)24～29個，誘導(dǎo)時間7～11 d，誘導(dǎo)率80.00%～96.67%，最佳激素組合為6-BA 0.2 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1，7 d誘導(dǎo)率96.67%。由此確定全紅楊葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2 mg·L-1+NAA0.05 mg·L-1+蔗糖25.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

表1 葉柄愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.2 不定芽分化培養(yǎng)基的篩選

葉柄在愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月左右，選擇松脆呈嫩紅色的愈傷組織轉(zhuǎn)移至不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d后愈傷組織由紅色變成綠色，20 d后分化出許多嫩綠色小芽點，25 d分化出多而密的叢生芽。轉(zhuǎn)接1次后不定芽在分化培養(yǎng)基中抽莖展葉，呈深綠色。

由表2可見，從接種第25 d開始，平均分化芽9.6～17.8個，分化率80%～100%。最佳組合為6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1，開始分化時間25 d，平均分化芽17.8個，平均分化率100%。因此確定全紅楊最佳不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.5。

2.3 不定芽生根培養(yǎng)基的篩選

從接種第16 d開始不定芽生根，生根的不定芽18～24個，平均生根7.8～13.5條，生根率75%～100%(表3)。當(dāng)IBA濃度相同而基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同時，1/2MS培養(yǎng)基中的不定芽平均生根數(shù)和生根率均高于MS培養(yǎng)基。無論MS或1/2 MS培養(yǎng)基，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同時，隨著IBA質(zhì)量濃度增大，不定芽平均生根數(shù)和生根率均先增大后減小。全紅楊最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3mg·L-1+蔗糖20.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

表2 葉柄不定芽分化情況

表3 不定芽生根情況

2.4 組培苗移栽

2.4.1 室內(nèi)移栽

根系發(fā)達(dá)、高5 cm以上的組培苗，打開瓶半封膜，適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境2～3 d。用鑷子夾取組培苗，用常溫清水輕輕洗去根系上附著的培養(yǎng)基，剪掉較長根系，移栽在裝有滅菌基質(zhì)(腐殖土∶大田土∶河沙=1∶1∶1)的營養(yǎng)杯中，使苗木根系均勻分布于培養(yǎng)容器內(nèi)，放在室內(nèi)培養(yǎng)，定期澆水，保持基質(zhì)濕潤。光照強(qiáng)烈時用遮陽網(wǎng)遮光保濕，保證栽培基質(zhì)含水量75%，控制空氣濕度75%～90%。

2.4.2 大田移栽

待容器生根苗高20～30 cm時，移栽到育苗試驗地，選擇土壤肥沃、通氣性好、灌溉方便的地塊。一般7-8月份移栽，最好在傍晚或陰天進(jìn)行，移栽前澆足底水。移栽時去掉外面的容器，將容器內(nèi)的基質(zhì)一起栽植于大田，栽后及時澆水。

3 結(jié)論與討論

本研究以全紅楊葉柄為外植體，建立了全紅楊組織培養(yǎng)與快繁體系。采回葉柄用流動的自來水沖洗，用75%酒精沖洗3次后浸泡30 s，用無菌水沖洗3次，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡6 min滅菌。誘導(dǎo)愈傷組織用2，4-D、NAA[23]，本研究用NAA和6-BA配合使用誘導(dǎo)愈傷組織，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1、NAA為0.05 mg·L-1時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高96.67%。試驗還剪取葉片為外植體，而葉片均未誘導(dǎo)出愈傷組織，可能是滅菌時HgCl2溶液浸泡時間長或培養(yǎng)基激素配比不合適造成的。細(xì)胞分裂素可促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和不定芽的形成，不定芽分化與NAA和6-BA的比值有關(guān)，常采用NAA和6-BA來誘導(dǎo)楊樹不定芽的分化，其再生率高。當(dāng)NAA/6-BA≥1/10時，會促進(jìn)不定芽分化。本研究在誘導(dǎo)不定芽分化時，培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，分化芽數(shù)最多，長勢好，分化率最高，分化效果最好。全紅楊愈傷組織在不定芽分化培養(yǎng)基上經(jīng)過一個由紅褐色轉(zhuǎn)為淺綠色的過程，因此分化時間稍長，全紅楊只有在自然光照射下才呈現(xiàn)紅褐色，而在人工光源或模擬光源照射下為綠色。培養(yǎng)基中無機(jī)鹽減半會促進(jìn)不定根的發(fā)育，使用1/2MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)的效果好于MS基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根用IBA效果最好[24]，IBA質(zhì)量濃度會影響根細(xì)胞的分化，低質(zhì)量濃度有利于根細(xì)胞分化，較高質(zhì)量濃度會對根分化產(chǎn)生脅迫，阻礙根的生成。本研究在IBA質(zhì)量濃度相同時，1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不定芽平均生根數(shù)和生根率均高于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，生根效果好。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同時，隨著IBA質(zhì)量濃度增大，平均生根數(shù)和生根率均先增大后減小，可見低質(zhì)量濃度IBA有利于根細(xì)胞的分化，較高質(zhì)量濃度IBA阻礙根的生成。

通過試驗得到全紅楊組織培養(yǎng)的最佳配方：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖25.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0；不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.5；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0，為今后進(jìn)行楊樹良種選育、種質(zhì)資源保存、擴(kuò)大栽培與推廣等提供研究基礎(chǔ)。