趙璐，馮金歌，付佳，汪亞倫，鄒鵬

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034）

目前結(jié)腸癌是臨床上最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生于直腸與乙狀結(jié)腸交界處。在全球惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率分別位于第四、二位［1］，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤。臨床上對(duì)結(jié)腸癌的治療方法主要采用放療、手術(shù)及中藥輔助化療綜合治療方法。但是化療不僅抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生一定的損害。根治性手術(shù)后5年生存率僅有50%左右［2］。因此對(duì)高效低毒的天然抗腫瘤藥物的需求極為迫切。大蔥 （Allium fistulosum（L.）var.giganteum）屬百合科，是多年生草本植物， 黃雪松［3］采用氣相色譜／質(zhì)譜 （GC／MS） 法鑒定揮發(fā)油中化學(xué)成分，主要含有含硫化合物、不飽和脂肪酸、萜烯類化合物等，所鑒定出來的化合物成分約占其總含量的90%。研究發(fā)現(xiàn)大蔥油具有潛在的抗腫瘤作用［4］，大蔥油能夠誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞G2／M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位［5］。Belman等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與大蔥油同屬的洋蔥和大蒜素能夠抑制小鼠皮膚腫瘤細(xì)胞的增殖。但大蔥油對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察大蔥油作用后對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響，并初步探討大蔥油抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多方位治療腫瘤提供理論依據(jù)，為臨床治療結(jié)腸癌尋找新藥物。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 正常人結(jié)腸細(xì)胞CCD-18Co和結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購自美國ATCC公司。噻唑藍(lán) （MTT）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 （FBS）購自美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗、二甲基亞砜 （DMSO）、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；抗體Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑、ECL發(fā)光試劑購自上海碧云天生物科技有限公司；SuperScriptⅢ試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱 （Thermo Forma SeriesⅡ）；倒置顯微鏡XSZ-DZ（重慶光學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水箱 （中國恒科公司）；超凈工作臺(tái) （北京半導(dǎo)體設(shè)備廠）；紫外吸收光度儀、Western blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備 （美國 BioRad公司）；流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；液氮運(yùn)輸儲(chǔ)存罐（東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司）；顯影機(jī) （日本柯達(dá)公司）；StepOne型號(hào)熒光定量PCR儀 （美國AB Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 大蔥油制備 取當(dāng)?shù)責(zé)o農(nóng)藥污染的新鮮大蔥去皮和葉，取蔥白，用常壓蒸餾法和水醇法提取大蔥油。100℃、流通蒸汽滅菌30 min，避光保存，采用DMSO稀釋成各種所需濃度備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將CCD-18Co和SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為DMSO的陰性對(duì)照組和大蔥油（25、 50、 100 μg／ml） 組。

1.3.3 MMT實(shí)驗(yàn) 將消化后的細(xì)胞制成2×104個(gè)／ml細(xì)胞懸液， 按 100μl／孔接種于 96孔板中，每孔加入20μl MTT后，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，水平震蕩10 min后，酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的吸光度值。以吸光度值代表細(xì)胞數(shù)目。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布 將SW480細(xì)胞以5×106個(gè)／ml接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 （分組同上），48 h后，用冰PBS洗滌2次、離心收集細(xì)胞。用預(yù)冷70%乙醇固定4℃過夜，PBS洗滌3次后加入1 mg／ml PI染液，室溫避光孵育30 min后，以5×106個(gè)／ml上樣流式細(xì)胞儀，檢測細(xì)胞周期分布。

1.3.5 Annexin V-FITC／PI雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡采用DMSO和50、100μg／ml大蔥油處理 SW480細(xì)胞24 h，消化離心，收集各組細(xì)胞，用0.01 mol／L PBS （pH 7.3） 輕洗2 次； 1 000 r／min 離心5 min，棄上清，用500μl膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC避光染色10 min，再加入10μl PI于室溫下避光孵育5 min；上流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞凋亡百分率。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、 CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、MMP9、LIMK1和Cofilin基因表達(dá) 收集各組處理 24 h后的細(xì)胞，4℃ 500 r／min離心3 min收集細(xì)胞，按 TRizol試劑說明書抽提總RNA，按SuperScriptⅢ試劑盒說明書合成第一條鏈cDNA，以合成的cDNA為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的引物序列見表1。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 15 s循環(huán)40次，60℃延伸1 min。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的引物序列

1.3.7 Western blot法檢測細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3蛋白的表達(dá) 將SW480細(xì)胞以5×106個(gè)／ml接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 （分組同上），48 h后，4℃ 500 r／min離心3 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次。然后按照細(xì)胞全蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行全蛋白提取，并以Bradford法測定蛋白濃度后-70℃保存?zhèn)溆?。?5%SDS-PAGE分離40μg全蛋白，電轉(zhuǎn)至NC膜，用TBST配置5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶2 000稀釋的抗體 Cyclin D1、 CDK4、 CDK6、Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、 MMP2、MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、 Cofilinp-Ser3，4℃孵育過夜，然后取出NC膜，TBST室溫洗3次，每次5 min。加入二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。在暗室里，按照1∶1的比例混合發(fā)光底物A、B液。取出膜放入Bio-Rad顯像儀。保存圖片并使用Quantity One分析軟件對(duì)圖像灰度進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蔥油對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT法檢測大蔥油對(duì)CCD-18Co和SW480細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與正常人結(jié)腸細(xì)胞CCD-18Co組結(jié)果相比，大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性 （P＜0.01）（圖1A、B）。大蔥油作用SW480細(xì)胞24 h的最佳藥物濃度為 100 μg／ml。 100 μg／ml大蔥油作用于CCD-18Co和SW480細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞組的細(xì)胞抑制率顯著高于CCD-18Co組 （P＜0.01） （圖 1C）。

2.2 大蔥油作用后SW480細(xì)胞周期受阻 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，不同濃度的大蔥油作用24 h后，SW480細(xì)胞停滯在G2／M期（P＜0.01），見圖2A。并且，大蔥油的作用濃度越高，阻滯在G2／M期的細(xì)胞比例越高。結(jié)果顯示，大蔥油誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的阻滯在G2／M期。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法結(jié)果見圖2B、C，分別采用DMSO和25、50、100μg／ml大蔥油作用SW480細(xì)胞24 h后，分別檢測周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表達(dá)，大蔥油能夠抑制Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表達(dá)，且隨著大蔥油濃度的升高抑制作用逐漸顯著。

2.3 Annexin V-FITC／PI雙染檢測大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC／PI雙染檢測結(jié)果顯示，隨著大蔥油作用濃度的增加，SW480細(xì)胞凋亡率顯著升高，濃度越高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用越明顯，見圖3A。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測結(jié)果見圖3B、C所示，分別采用DMSO和25、50、100μg／ml大蔥油作用SW480細(xì)胞24 h后，分別檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表達(dá)，大蔥油能夠抑制Bcl-2的基因及蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表達(dá)，且隨著大蔥油濃度的提高抑制和促進(jìn)作用逐漸顯著，且呈濃度依賴性。

圖1 大蔥油作用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響 分別采用DMSO和25、50、100μg／mL大蔥油作用 SW480細(xì)胞24 h后，分別檢測與細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3的基因及蛋白表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著給藥濃度的逐漸增加，MMP2、MMP9的基因表達(dá)量明顯受到抑制 （P＜0.01）， 而LIMK1、Cofilin的基因的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著大蔥油濃度的逐漸增加，MMP2、 MMP9、 LIMK1p-Thr508、 Cofilinp-Ser3蛋白表達(dá)量明顯受到抑制 （P＜0.01）；LIMK1和 Cofilin的磷酸化水平顯著降低，而LIMK1和Cofilin蛋白表達(dá)量沒有顯著下降，大蔥油抑制LIMK1、Cofilin磷酸化。見圖4。

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，增加了結(jié)腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，目前其發(fā)病率和致死率在國內(nèi)外均有上升的趨勢，早期結(jié)腸癌5年的生存率大約為90%，但是一旦發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移其生存率僅為15%，盡管近些年來研發(fā)出許多早期診斷和治療的方法，但是這種現(xiàn)象沒有得到改善，而且出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥是治療失敗的主要原因，嚴(yán)重威脅人類健康［7］。因此，尋找能預(yù)防和治療結(jié)腸癌的新藥非常必要。

圖2 大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞周期的影響

圖3 大蔥油作用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖4 大蔥油對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響

近年來，人們致力于尋求抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移侵襲的天然藥物，因?yàn)槠淇山档突熕幬锏亩靖弊饔?，增?qiáng)化療藥物的抗癌作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鮮大蔥可能通過降低胃液中亞硝酸鹽含量，從而降低患胃癌風(fēng)險(xiǎn)［8］，但大蔥油對(duì)結(jié)腸癌的作用尚未引起人們的高度重視。

本研究結(jié)果表明大蔥油可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖，而這種抑制作用是通過停滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。大蔥油處理的SW480細(xì)胞中，與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)蛋白 （Cyclin D1、CDK4和 CDK6）和與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、 Bax、 Caspase-9和Caspase-3） 表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化，結(jié)果提示，大蔥油的抗癌效果是通過對(duì)一些腫瘤生物學(xué)途徑如細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡途徑等發(fā)揮多重作用來實(shí)現(xiàn)的。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)主動(dòng)過程，癌細(xì)胞通過運(yùn)動(dòng)穿破宿主結(jié)締組織、血管、淋巴管壁，從而進(jìn)入體液循環(huán)，再穿破結(jié)締組織、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成轉(zhuǎn)移灶。MMPs是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜的蛋白水解酶，還能夠調(diào)節(jié)血管生長因子的作用，所以在腫瘤生長轉(zhuǎn)移和血管生成的過程中發(fā)揮重要作用。MMP2和MMP9能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［9-10］。此外，LIM激酶 （LIMK）能夠參與細(xì)胞周期進(jìn)展、腫瘤新生血管生成及腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移、增殖等多種行為［11-12］。 絲切蛋白 （Cofilin） 在多種人類腫瘤中高表達(dá)，尤其在高侵襲性腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，提示其可作為預(yù)測惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)記物［13］。本文檢測了大蔥油對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480侵襲、遷移能力的影響，當(dāng)SW480細(xì)胞采用不同濃度的大蔥油處理后，與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白表達(dá)都會(huì)顯著下調(diào)，提示大蔥油能夠抑制SW480細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，大蔥油對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞有顯著的抗腫瘤活性，主要通過阻滯G2／M期，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。因此，大蔥油可以作為治療人結(jié)腸癌的有效藥物，同時(shí)為開發(fā)一種抗腫瘤藥物或藥物前體提供一定參考。本研究也將繼續(xù)深入研究大蔥油抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制，為靶向防治結(jié)腸癌的藥物和高效低毒的創(chuàng)新藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。