鐘彩梅 何思華 趙偉峰 鐘建能 周美鳳 鄧裕華

1廣東省佛山市順德區(qū)慢性病防治中心皮膚科528399；2南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣州510515

蠕形螨（Demodex spp.）常寄生于皮脂腺分泌旺盛的皮膚組織［1］，毛囊蠕形螨（D.folliculorum）較為常見，常寄生在臉頰、鼻唇溝等處［2］及皮脂腺漏斗處的角質(zhì)層或其碎片中，可引起紅斑、脫屑等癥狀；皮脂腺蠕形螨（D.brevis）則多存在于皮脂腺腺體和導(dǎo)管中，軀干常見，容易導(dǎo)致膿皰、丘疹等［3］。人體皮膚表面含有大量的微生物，微生物之間相互影響、制約，與人體免疫系統(tǒng)共同構(gòu)建一道天然的防御屏障［4］。蠕形螨是否致病與多種因素相關(guān)，酒渣鼻是目前所知的與蠕形螨密切相關(guān)的一種皮膚疾?。?］。目前，蠕形螨引起皮膚炎癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確。作為病原微生物的載體，蠕形螨在皮膚表面活動(dòng)，可攜帶一些病原體，如葡萄球菌、鏈球菌，通過細(xì)菌超抗原或直接刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而發(fā)揮致病作用［6］。我們選擇酒渣鼻患者為研究對(duì)象，采集鼻部皮膚的微生物樣品，通過宏基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，探討蠕形螨的寄生對(duì)局部皮膚微生態(tài)的影響。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2017 年5 月至2019 年6 月于佛山市順德區(qū)慢性病防治中心皮膚科就診的酒渣鼻患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合酒渣鼻的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②患者簽署知情同意書；③入組前2 ～3 周內(nèi)沒有局部外用過抗生素、維A 酸類藥物及性激素、糖皮質(zhì)激素等藥物治療；④非妊娠期及哺乳期；⑤無高血脂、肝腎功能異常、痤瘡、接觸性皮炎等疾病。招募面部健康志愿者為健康對(duì)照，納入標(biāo)準(zhǔn)：①面部無炎癥性表現(xiàn)（即紅、腫、熱、痛等）；②簽署知情同意書；③無吸煙史，入組前2 ～3 周內(nèi)臉部未使用過抗生素、維A 酸類藥物及糖皮質(zhì)激素類藥物等；④非妊娠期及哺乳期；⑤無高血脂、肝腎功能異常等系統(tǒng)性疾病。本研究經(jīng)佛山市順德區(qū)慢性病防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入酒渣鼻患者與健康對(duì)照各14例。酒渣鼻患者男5例，女9例，年齡（29.79±2.53）歲。健康對(duì)照組男7 例，女7 例，年齡（31.21±1.33）歲，兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

依據(jù)酒渣鼻的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，進(jìn)一步將疾病組分為紅斑期（早期）和丘疹膿皰期（中期）。早期8例，男3例，女5例；中期6例，男2例，女4例。

二、鼻部皮膚微生物樣品采集

采集受試者鼻部皮膚微生物時(shí)，夾住MF 濾膜（型號(hào)REF:HAWP01300，直徑0.45 μm，美國(guó)Merck Millipore 公司）緊貼鼻唇溝和鼻翼皮膚表面來回摩擦5 ～10次。將MF濾膜放入含有1 μl蛋白酶K和300 μl組織和細(xì)胞裂解液（DNA、RNA 純化試劑盒，英國(guó)Epicentre 公司）的EP 管中。取樣過程注意無菌操作。樣品保存于-80 ℃冰箱待用。兩組另設(shè)3 管陰性對(duì)照，分別為未接觸皮膚的MF 濾膜、1 μl蛋白酶K、300 μl組織和細(xì)胞裂解液的EP管。

三、DNA提取及宏基因組測(cè)序

皮膚微生物DNA 的提取按DNA、RNA 純化試劑盒（英國(guó)Epicentre 公司）說明書操作。通過超聲碎裂儀（比利時(shí)Diagenode公司）將總量約100 ng 的DNA碎裂成長(zhǎng)度為300 ～400 bp的DNA片段；通過DNA 文庫純化試劑盒（美國(guó)Kapa Biosystems 公司）構(gòu)建DNA 測(cè)序文庫。使用HiSeq 2500 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司）對(duì)DNA 文庫進(jìn)行雙端測(cè)序，保存測(cè)序的原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。測(cè)序由中山大學(xué)中山眼科中心魏來教授課題組完成。

四、數(shù)據(jù)分析

1. 微生物數(shù)據(jù)：使用質(zhì)量控制軟件（FastQC、Cutadapt、Fastx、PrinSeq）對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，在得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)中去除人的數(shù)據(jù)，得到不含宿主數(shù)據(jù)的高質(zhì)量微生物數(shù)據(jù)。

2. 微生物相對(duì)含量：采用序列比對(duì)軟件HiSAT2（v2.0.1）在通用微生物數(shù)據(jù)庫中比對(duì)該高質(zhì)量微生物數(shù)據(jù)，對(duì)成功匹配的微生物基因組進(jìn)行物種注釋。采用Bedtools（v2.19.1）軟件計(jì)算蠕形螨基因組覆蓋度，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)蠕形螨基因組片段的樣品總數(shù)占所有樣品數(shù)的百分比，即蠕形螨基因組片段出現(xiàn)率。采用ROC分析基因組覆蓋度與基因組片段出現(xiàn)率的推薦截點(diǎn)。當(dāng)蠕形螨的覆蓋率＞3%和出現(xiàn)概率＞2%時(shí)，可認(rèn)為提取到蠕形螨DNA。

由于蠕形螨基因組的大小與其它微生物，如細(xì)菌、真菌，基因組的大小存在明顯差異，故采用微生物reads 數(shù)占總微生物reads 數(shù)的百分比反映微生物的相對(duì)含量?；诟魑⑸飿?gòu)成比，分析蠕形螨與細(xì)菌、真菌等其他微生物群落的相關(guān)性。

3.皮膚微生物群落的多樣性：采用Mothur軟件計(jì)算Shannon 指數(shù)（Shannon index）以評(píng)估微生物α多樣性，衡量微生物種類多樣性。采用R 軟件（v3.4.3）分析基于菌種相對(duì)豐度的主成分分析（principal component analysis，PCA），以PC1 的數(shù)值評(píng)估β 多樣性，間接反映組間物種相對(duì)豐度的差異。

4.酒渣鼻患者與健康對(duì)照組鼻部皮膚微生物群落的代謝途徑：通過微生物京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）重建代謝途徑，通過HMP Unified Metabolic Analysis Network（HUMAnN2）軟件分析各種代謝途徑占微生物總體的代謝途徑的相對(duì)豐度，并以此反映代謝途徑的活躍程度。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用±s 表示及兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。采用R軟件（v3.4.3,www.r-project.org）進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，｜r｜0 ～0.09為無相關(guān)性，0.1 ～＜0.3為弱相關(guān)，0.3 ～＜0.5 為中等相關(guān)，0.5 ～＜1.0 為強(qiáng)相關(guān)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、鼻部皮膚微生物數(shù)據(jù)

健康組單樣本總測(cè)序reads 數(shù)目為（42.2 ～67.2）M，其中大部分?jǐn)?shù)據(jù)來源于宿主人，每個(gè)樣品可獲得（3.2 ～13.4）M 高質(zhì)量微生物reads，占總測(cè)序reads 數(shù)目的7.6%～19.9%。酒渣鼻組單樣本總測(cè)序reads數(shù)目為（28.1 ～70.4）M，大部分?jǐn)?shù)據(jù)亦來源于宿主人，每個(gè)樣品可獲得（2.4 ～9.5）M高質(zhì)量微生物reads，占總測(cè)序reads 數(shù)目的8.5% ～13.5%。兩組的6 個(gè)陰性對(duì)照的樣品數(shù)據(jù)均為重復(fù)、無效或低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，且未獲得足夠可用于分析的微生物數(shù)據(jù)，未做統(tǒng)計(jì)。

二、鼻部皮膚含有蠕形螨基因組片段數(shù)據(jù)

蠕形螨基因組中共531 個(gè)基因組片段，其中509 個(gè)基因組片段的出現(xiàn)概率為2.7% ～100%，覆蓋度為0.07%～96.31%（圖1）。結(jié)合ROC 曲線（圖2），滿足覆蓋率＞3%和出現(xiàn)概率＞2%的基因組片段共15個(gè)（表1）。酒渣鼻組蠕形螨reads數(shù)構(gòu)成比為1.647% ± 0.389%，健康組為0.448% ± 0.089%，酒渣鼻組高于健康對(duì)照組（t=2.92，P=0.007）。見圖3。

總體相關(guān)性分析結(jié)果顯示，蠕形螨與細(xì)菌的reads 數(shù)構(gòu)成比呈負(fù)相關(guān)（r=-0.95，P ＜0.001），與真菌和古生菌呈正相關(guān)（r = 0.76、0.94，均P ＜0.001），而與病毒不相關(guān)（r = 0.31，P = 0.456），見圖4。

圖1 標(biāo)本檢測(cè)出的蠕形螨基因組片段的出現(xiàn)概率與覆蓋度 檢測(cè)到531 個(gè)蠕形螨基因組基因組片段，其中509 個(gè)片段的出現(xiàn)概率為2.7%～100%，覆蓋度為0.07%～96.31% 圖2 采用ROC曲線分析蠕形螨基因組DNA片段的出現(xiàn)概率和覆蓋度 圖中數(shù)字分別表示推薦截點(diǎn)（括號(hào)外）、敏感度和特異度（括號(hào)內(nèi)），曲線下面積（AUC）越大，推薦截點(diǎn)的可信度越高

表1 覆蓋率＞3%且出現(xiàn)概率＞2%的蠕形螨基因組片段

圖3 宏基因組測(cè)序分析標(biāo)本中蠕形螨的相對(duì)含量 酒渣鼻組高于健康組（P ＜0.05）

三、鼻部蠕形螨與皮膚細(xì)菌和真菌群落間的相對(duì)關(guān)系

酒渣鼻組鼻部皮膚的細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)（0.91 ± 0.17）顯著高于健康組（0.47 ± 0.12，t =2.17，P=0.041），兩組間α 多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCA 分析顯示，兩組間鼻部皮膚細(xì)菌相對(duì)豐度的主成分為痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P. acnes），酒渣鼻組相對(duì)豐度（78.13%±5.16%）低于健康組（91.58% ± 2.05%，t =2.42，P=0.023）。細(xì)菌群落β 多樣性酒渣鼻組PC1為0.141±0.391，健康組為-0.787±0.087，兩組差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.32，P = 0.029）（圖5）。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蠕形螨與大部分細(xì)菌，如表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌（出現(xiàn)概率＞66.7%）呈中等或強(qiáng)正相關(guān)（均P ＜0.05），僅與一種細(xì)菌P. acnes 呈中等負(fù)相關(guān)（r =-0.49，P =0.010）。見圖6、7。

圖4 酒渣鼻患者鼻部皮膚各種微生物之間總體相關(guān)性分析圖中數(shù)字為Pearson 相關(guān)系數(shù)，以各微生物構(gòu)成比計(jì)算，圓形顏色深度表示相關(guān)系數(shù)大小?！帘硎鞠嚓P(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＞0.05

酒渣鼻組鼻部皮膚的真菌群落Shannon 指數(shù)（1.261±0.045）高于健康對(duì)照組（0.549±0.071，t=8.48，P ＜0.001），兩組間α 多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCA分析顯示，酒渣鼻組和健康組間鼻部皮膚真菌的主成分分析無顯著差異，其中主要以真菌球形馬拉色菌（Malassezia globosa）為主，該菌在酒渣鼻組相對(duì)豐度（84.84% ± 1.27%）與健康對(duì)照組（83.16% ± 1.82%）間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.35，P=0.172）。真菌群落的β 多樣性酒渣鼻組PC1為-0.160 ± 0.325，健康組為0.136 ± 0.184，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.82，P=0.416）（圖5）。相關(guān)性分析結(jié)果示，相對(duì)含量低的真菌和大部分含量較高的真菌相對(duì)豐度與蠕形螨相對(duì)含量無相關(guān)性或呈弱中負(fù)相關(guān)（均P ＜0.05，），只有球形馬拉色菌、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和鏈孢霉菌（Neurospora crassa）與蠕形螨呈中度或強(qiáng)正相關(guān)（r=0.39、0.43、0.51，均P ＜0.05）。見圖6。這3 種真菌的相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.88，P ＜0.001），球形馬拉色菌最高（圖7）。球形馬拉色菌相對(duì)豐度與蠕形螨相對(duì)含量呈中等正相關(guān)（r =0.39，P=0.04，圖8）。

圖5 主成分分析法比較健康組和酒渣鼻組群落的種類及其相對(duì)豐度差異紅色橢圓表示健康對(duì)照組，黑色橢圓表示酒渣鼻組，兩橢圓重疊部分越多表示差異越小

四、酒渣鼻組與健康對(duì)照組間鼻部皮膚微生物群落的代謝途徑存在差異

通過比較、分析微生物群落的代謝途徑，結(jié)果示，酒渣鼻組微生物群落的部分代謝途徑相對(duì)豐度（0.000 16%±0.000 017%）低于健康組（0.000 27%±0.000 022%，t = 15.11，P ＜0.001），其中27 個(gè)代謝途徑豐度差異明顯（酒渣鼻組：0.000 23% ±0.000 008%，健康組：0.000 34% ± 0.000 011%，t =7.66，P ＜0.001），主要表現(xiàn)在DNA 核苷酸、蛋白氨基酸、葉酸和輔酶A的生物合成減弱。見圖9。

五、早中期酒渣鼻患者鼻部蠕形螨與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

圖6 蠕形螨相對(duì)含量和各種細(xì)菌、真菌相對(duì)豐度之間的相關(guān)性 6A：橙色方形虛線框內(nèi)為多數(shù)出現(xiàn)率較高的細(xì)菌，與蠕形螨相對(duì)含量呈中等或強(qiáng)正相關(guān)，僅痤瘡丙酸桿菌（綠色圓形虛線框）與之呈中等負(fù)相關(guān)；6B：相對(duì)含量低的真菌和大部分含量較高的真菌與蠕形螨相對(duì)含量呈弱、中負(fù)相關(guān)（橙色方形虛線框）或無相關(guān)性，只有球形馬拉色菌、黃曲霉和鏈孢霉（綠色橢圓形虛線框）與蠕形螨呈中度或強(qiáng)正相關(guān)

中期酒渣鼻患者蠕形螨相對(duì)含量（3.080% ±0.427%）高于早期患者（0.573%±0.099%，t=6.56，P ＜0.001）。盡管如此，早期患者的細(xì)菌和真菌群落Shannon 指數(shù)（0.665±0.225、1.288±0.073）與中期患者（0.831 ± 0.269、1.225 ± 0.041）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.76、0.68，均P ＞0.05），細(xì)菌和真菌群落的α 多樣性均未受病情影響，PCA 分析顯示，早中期患者細(xì)菌、真菌β多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.23、2.41，均P ＜0.05，圖10）。中期患者微生物群落代謝途徑的相對(duì)豐度亦顯著低于早期（t =5.78，P ＜0.001，圖11）。

討 論

蠕形螨具有嚴(yán)格的宿主特異性，寄生在人體皮膚的有2種，毛囊蠕形螨和皮脂腺蠕形螨。我們將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到毛囊蠕形螨基因組上，得到滿足堿基覆蓋率＞3%和出現(xiàn)概率＞2%的基因組片段15 個(gè)，因此可以認(rèn)為我們?cè)诒遣科つw上提取到了蠕形螨DNA，它們可能來源于蠕形螨基因組DNA或其代謝產(chǎn)物、外泌體DNA。由于兩種蠕形螨的親緣關(guān)系較近［1］，故本研究中所得到的蠕形螨數(shù)據(jù)應(yīng)考慮為兩種蠕形螨數(shù)據(jù)的總和。

人體皮膚表面含有大量的微生物，研究顯示每平方米可達(dá)1×1011個(gè)微生物［8-9］，微生物之間相互影響、制約，維持著皮膚的健康。本研究分析了蠕形螨與細(xì)菌、真菌、古生菌相對(duì)含量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，皮膚細(xì)菌與蠕形螨呈負(fù)相關(guān)，而真菌、古生菌與其呈正相關(guān)，提示微生物之間可能存在相互影響，相互制約。由于古生菌是皮膚正常菌群［10］，雖然也與蠕形螨呈正相關(guān)，但目前未有該菌與蠕形螨相互影響、相互促進(jìn)的研究，我們亦不甚了解這兩者間的內(nèi)在關(guān)系。

圖7 3種與蠕形螨正相關(guān)的真菌在鼻部皮膚上的相對(duì)豐度 球形馬拉色菌相對(duì)豐度最高 圖8 蠕形螨相對(duì)含量與菌種相對(duì)豐度的相關(guān)性 8A：與痤瘡丙酸桿菌相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)；8B：與球形馬拉色菌相對(duì)豐度呈正相關(guān)

圖9 酒渣鼻組與健康對(duì)照組皮膚微生物群落代謝途徑的差異 9A：實(shí)線框內(nèi)的代謝途徑，酒渣鼻組代謝途徑的活躍程度明顯低于健康對(duì)照組；9B：為9A中虛線框部分，27個(gè)代謝途徑豐度差異明顯

圖10 主成分分析法比較早期和中期酒渣鼻組細(xì)菌、真菌群落的種類及其相對(duì)豐度差異 紅色橢圓表示健康組，黑色橢圓表示酒渣鼻組，兩橢圓重疊部分越多表示差異越小

圖11 早、中期酒渣鼻患者微生物群落代謝途徑的差異 中期患者微生物群落代謝途徑的相對(duì)豐度低于早期

我們對(duì)比了酒渣鼻患者與健康對(duì)照間鼻部皮膚微生態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)酒渣鼻患者皮膚組織的細(xì)菌α多樣性增加，β多樣性也發(fā)生了改變，提示不僅細(xì)菌的種類發(fā)生了改變，其含量也發(fā)生了改變。數(shù)據(jù)顯示，大部分細(xì)菌含量與蠕形螨呈中度或強(qiáng)正相關(guān)，僅與P. acnes 呈負(fù)相關(guān)。P. acnes 是皮膚中最主要的且含量最多的一種細(xì)菌，如發(fā)生疾病或者受到外界因素的影響，其在皮膚表面的含量也可能最容易受到影響。P. acnes 的相對(duì)豐度隨蠕形螨的含量增多而減少，提示P.acnes可能對(duì)皮膚蠕形螨的寄生產(chǎn)生一定的抑制作用。P. acnes 可產(chǎn)生丙酸，調(diào)節(jié)皮膚表面的酸堿度，影響蠕形螨的生存［11-12］。此外，P.acnes 也可競(jìng)爭(zhēng)性地消耗皮脂中的脂肪酸，使蠕形螨不能獲取足夠的脂肪酸而生長(zhǎng)受到一定的抑制。酒渣鼻患者與健康對(duì)照皮膚組織間真菌的α 多樣性改變，β 多樣性無差異，提示真菌的種類發(fā)生了改變。皮膚上大部分真菌的含量和蠕形螨不相關(guān)，雖有少數(shù)幾種與蠕形螨呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但其平均相對(duì)豐度低于1%，因此尚不能確定是否能抑制蠕形螨寄生。鼻部皮膚的主要真菌為球形馬拉色菌，其含量與蠕形螨呈正相關(guān)，提示球形馬拉色菌可能對(duì)蠕形螨的寄生有促進(jìn)作用。球形馬拉色菌是一種嗜脂性真菌，依賴皮質(zhì)中的磷脂、脂肪酸［13］，產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物可能給蠕形螨提供了所需的食物來源。盡管如此，P.acnes和球形馬拉色菌與蠕形螨之間的相互關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

皮膚疾病的發(fā)生和發(fā)展能在一定程度上破壞局部皮膚組織的微生態(tài)結(jié)構(gòu)［14-15］，已有研究證實(shí)，酒渣鼻的病情與蠕形螨密切相關(guān)［5］。故我們還初步探討了不同嚴(yán)重程度的酒渣鼻與蠕形螨的關(guān)系，及蠕形螨與皮膚微生物群落之間的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著酒渣鼻病情加重，蠕形螨的相對(duì)豐度也隨之增加，但皮膚細(xì)菌和真菌的種類未發(fā)生顯著改變，一方面可能由于酒渣鼻組再分期后樣本量較少，另一方面可能由于疾病早期和中期的分界不明顯，在臨床判斷過程中分類有誤所致。然而從PCA結(jié)果顯示，細(xì)菌和真菌的相對(duì)豐度發(fā)生了變化，疾病中期微生物代謝途徑亦顯著低于早期，這表明酒渣鼻病情對(duì)鼻部皮膚微生態(tài)存在一定程度的影響。但由于我們收集的病例無晚期酒渣鼻患者，蠕形螨在其鼻部皮膚的含量、微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝途徑的變化尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們認(rèn)為酒渣鼻的發(fā)生發(fā)展與蠕形螨的寄生和皮膚局部微生態(tài)的改變有關(guān)。但蠕形螨的寄生，是疾病破壞了皮膚微生物群落的結(jié)果，還是作為原因，破壞了皮膚微生物群落致使皮膚炎癥的發(fā)生還不明確。本研究?jī)H從健康與疾病的角度探討了蠕形螨的寄生對(duì)皮膚微生態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，并沒有探討健康皮膚人群中蠕形螨的寄生是如何影響正常皮膚微生態(tài)環(huán)境的；同時(shí)，本文的研究對(duì)象僅限于酒渣鼻患者，且病例數(shù)較少。因此，進(jìn)一步收集更多的皮膚微生物樣品分析不同年齡階段、不同疾病條件下蠕形螨與皮膚微生物之間的相互關(guān)系是我們下一步的研究方向。

志謝 中山大學(xué)中山眼科中心魏來教授提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)及高通量測(cè)序平臺(tái)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突