倪娜，楊艷，張琴，冷天艷，楊麗華

650101 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，近半個(gè)世紀(jì)以來，卵巢癌全世界范圍發(fā)病率上升近2～3倍[1]，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率中排名第二，而死亡率卻位居?jì)D科腫瘤之首[2]。漿液性卵巢癌是最常見的病理類型，發(fā)病隱匿,惡性程度高且預(yù)后差[3]。盡管近年來診療技術(shù)不斷改進(jìn)，但該病仍缺乏有效的篩查手段及早期診斷指標(biāo)和策略，約70%的患者在初診時(shí)已為晚期卵巢癌，標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合輔助性化療的治療方案亦很難達(dá)到治愈效果，并且超過70%的晚期患者因化療耐藥在2年內(nèi)復(fù)發(fā)，5年生存率仍徘徊在30%，嚴(yán)重威脅著人類健康[4]。因此，探索卵巢癌發(fā)病機(jī)制，尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，對(duì)于漿液性卵巢癌的診治具有重要的臨床意義。近些年研究顯示脂代謝與多項(xiàng)惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2(acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2,ACAA2)是脂肪酸氧化步驟中的關(guān)鍵酶之一，可通過催化脂肪酸β-氧化，參與脂肪酸降解及延伸，是脂代謝過程中一個(gè)重要調(diào)控因子。Guo等[5]研究報(bào)道,直腸癌患者中ACAA2表達(dá)高者預(yù)后更好。近年來，白屈菜的藥理作用越來越多的受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，對(duì)白屈菜中抗癌活性成分開展了一系列研究，其主要的有效成分為異喹啉生物堿以及一些非生物堿類成分，具有抗癌作用的活性成分為白屈菜生物堿類化合物，包括血根堿、白屈菜紅堿、白屈菜堿等[6]。多項(xiàng)研究表明血根堿有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用：Ma等[7]報(bào)道血根堿作用于Shh-Gli-Nanog pathway通路，抑制胰腺癌干細(xì)胞的增殖；Wei等[8]報(bào)道血根堿通過上調(diào)Fas相關(guān)因子1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。因此，從中草醫(yī)藥資源中挖掘新型抗腫瘤藥物，有望成為漿液性卵巢癌中草藥抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤信息，探討ACAA2在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及其預(yù)后關(guān)系，并分析血根堿對(duì)ACAA2基因表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)收集提取數(shù)據(jù)

根據(jù)如下篩選條件在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行設(shè)定，用來篩選和提取所需的數(shù)據(jù)信息，設(shè)定具體篩選條件如下：1) Gene:ACAA2；2)Analysis Type: Differential Analysis，CancervsCancer Analysis，CancervsNormal Analysis; 3)Cancer Type: Ovarian Cancer；4)Sample Type: Clinical Specimen; 5)Data Type: mRNA；6)臨界值設(shè)定條件(P<0.05, fold change>2, gene rank=top 10%)。設(shè)定研究結(jié)果采用箱狀圖展示。

1.2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kmplot.com/analysis/)分析患者生存周期

篩選條件如下：①“Cancer: Ovarian Cancer”；②“Gene:ACAA2”；③“Survival: OS”。

1.3 主要試劑及儀器

本課題實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的人漿液性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，購(gòu)自中科院昆明動(dòng)物研究所；血根堿(批號(hào):20150607，純度>98%，分子式:C20H14NO4)，購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；Affymetrix人全基因單通道表達(dá)譜芯片，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；超凈工作臺(tái)，SPEG AIR TECH，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；倒置相差熒光顯微鏡，DMIL LED，購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；冷凍離心機(jī)，D-37520，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)；恒溫振蕩器，TS-211B，購(gòu)自上海天呈實(shí)驗(yàn)器材制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，SI6R-2，購(gòu)自美國(guó)Shellab公司。

1.4 人漿液性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)

使用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和雙抗的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱中(設(shè)定培養(yǎng)條件：溫度37.0 ℃、濃度5%CO2、濕度95%)。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底面積八九成(貼壁率80%～90%)，經(jīng)過胰酶消化、傳代、收集、離心，篩選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞凍存。

1.5 應(yīng)用基因芯片檢測(cè)血根堿引起的差異表達(dá)基因

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL，每孔500 μL，分別接種于12孔培養(yǎng)板中，劃分血根堿組及對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔。6小時(shí)后于血根堿組加入含2.0 μmol/L血根堿培養(yǎng)液，對(duì)照組中則加生理鹽水； 48小時(shí)后應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞樣品中總RNA。使用Nanodrop ND-1000 UV進(jìn)行質(zhì)檢；根據(jù)RNeasy MiNi Protocol，使用QLAG-ENR Neasy?Kit提取純化總RNA。應(yīng)用Affymetrix人全基因單通道表達(dá)譜芯片，由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，進(jìn)行歸一化整理，歸一化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并行差異表達(dá)基因分析，以上調(diào)及下調(diào)2倍作為差異基因標(biāo)準(zhǔn)(|logFC|≥2，F(xiàn)DR<0.05，P<0.05)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ACAA2基因在人卵巢癌組織中的表達(dá)

自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)顯示，自2004年開始，共有9項(xiàng)研究涉及ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織和正常組織中的表達(dá)，共有1 569個(gè)樣本，文章分別發(fā)表于Br J Cancer、Cancer Res、Clin Cancer Res、Cancer Sci，并有1 168個(gè)來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)癌癥與腫瘤基因組圖譜)的樣本。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)這9項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACAA2基因在卵巢癌組織中表達(dá)顯著降低(P=0.028) (圖1)。

圖1ACAA2在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌中的表達(dá)

Figure 1.ACAA2Gene Expression in Ovarian Cancer in Studies Identified in Oncomine

2.2 不同數(shù)據(jù)集中ACAA2基因在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中有9項(xiàng)關(guān)于ACAA2基因卵巢腫瘤中表達(dá)水平的研究在Bonome等[9]、Hendrix等[10]、Lu等[11]、Yoshihara等[12]及TCGA數(shù)據(jù)集5項(xiàng)涉及漿液性卵巢癌的研究中，ACAA2在漿液性卵巢癌中的表達(dá)量均顯著低于正常卵巢組織(P均<0.05)(圖2)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ACAA2在不同卵巢癌研究芯片中的表達(dá)(P<0.05)

Figure 2.ACAA2Gene Expression in Different Ovarian Cancer Studies from Oncomine (P<0.05)

2.3 ACAA2水平與卵巢癌病患預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示：ACAA2表達(dá)高的卵巢癌患者總生存率高于表達(dá)低者(P<0.05)(圖3)。

圖3ACAA2水平與卵巢癌患者總體生存率之間的關(guān)系

Figure 3. Relationship betweenACAA2Levels and Overall Survival of Ovarian Cancer Patients

2.4 血根堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞ACAA2基因表達(dá)豐度的影響

基因芯片檢測(cè)血根堿作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后的基因表達(dá)譜，ACAA2為其中一個(gè)差異表達(dá)基因，血根堿處理后ACAA2水平顯著增高(P<0.001，F(xiàn)DR=9.22×10-7，|logFC|=3.15)(圖4)。

圖4 血根堿對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞ACAA2基因表達(dá)的影響(注：與對(duì)照組比較，***P<0.001)

Figure 4. Effect of Sanguinarine onACAA2Gene Expression in SKOV3 Ovarian Carcinoma Cells (Sanguinarine GroupvsControl Group,***P<0.001)

3 討 論

近年來，越來越多研究證實(shí)，脂質(zhì)代謝與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[13]、乳腺癌[14]、肺癌[15]、直腸癌[16]及胃癌[17]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，脂肪生成增加幾乎是所有癌細(xì)胞的共性，大部分產(chǎn)生的脂肪都在細(xì)胞增殖中用于細(xì)胞膜的構(gòu)建[18-19]。Kim等[20]提出卵巢癌惡性腹水中膽固醇升高，其機(jī)制是通過上調(diào)膽固醇受體LXR ɑ/β及藥物外排泵蛋白(ABCG2、MDR1)的表達(dá)來增加對(duì)PAC化療方案(包括順鉑DDP、阿霉素ADM及環(huán)磷酰胺CTX)的敏感性。Schafer等[21]首次證明了脂肪酸氧化對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝應(yīng)激狀態(tài)下的生存起著至關(guān)重要的作用。參與脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，如三磷酸腺苷-檸檬酸裂解酶、脂肪酸合酶以及乙酰輔酶A羧化酶在多種惡性腫瘤中表達(dá)活性增加[22]，并且Qiu等[23]的研究表明膳食脂肪攝入及脂肪酸膳食與卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)。

ACAA2是脂肪酸β-氧化途徑中的關(guān)鍵酶，參與體外脂肪細(xì)胞分化。ACAA2分布在線粒體中，脂肪酸在進(jìn)行β-氧化時(shí)產(chǎn)生的乙酰輔酶A，在ACAA2作用下催化縮合進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化釋放維持細(xì)胞活性所需的能量，參與脂肪酸代謝、調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡信號(hào)等，為參與脂類代謝的關(guān)鍵基因。多位學(xué)者研究認(rèn)為，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)通過ACAA2等關(guān)鍵基因作用于細(xì)胞脂肪酸攝取、線粒體脂肪酸氧化等途徑參與脂質(zhì)代謝，并提出ACAA2可能通過PPAR信號(hào)通路參與脂代謝[24-25]。本研究通過挖掘并分析Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的卵巢癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析生存數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)患者的預(yù)后更好，推測(cè)ACAA2基因在漿液性卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，并主要通過脂肪酸β-氧化途徑參與脂肪細(xì)胞的分化而發(fā)揮作用的。

中草藥提取物的抗癌作用歷史悠久，如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿和喜樹堿等已廣泛用于惡性腫瘤的治療[26]。近年來篩選以天然成為為主的有效且毒副作用小的中草藥抗癌藥物,并對(duì)具有抗癌活性的有效成分進(jìn)行深入研究已成為抗腫瘤藥物開發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。白屈菜ChelidoniummajusL，最早記載于《救荒本草》用作鎮(zhèn)痛藥，也有記載白屈菜用于胃癌、皮膚癌、肺結(jié)核以及皮膚膿瘡和蟲蛇咬傷等的治療[27]。目前白屈菜仍廣泛用與我國(guó)的多種方劑中，如天蟾膠囊、理肺止咳膠囊方、輔助肺癌化療的中藥制劑方[28]。烏克蘭應(yīng)用白屈菜提取白屈菜生物堿硫代磷酸復(fù)合物UKRAIN進(jìn)行胰腺癌的治療,取得良好療效[29]。血根堿為白屈菜主要成分之一，多項(xiàng)研究均證實(shí)血根堿可抑制胰腺癌及非小細(xì)胞肺癌[7-8]。本課題組在前期研究中也證實(shí)，血根堿可以抑制卵巢癌、耐藥卵巢癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，并有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用[30-31]。為探討ACAA2在卵巢癌治療中的靶點(diǎn)作用，我們團(tuán)隊(duì)通過人全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)了血根堿作用于卵巢癌細(xì)胞株后的基因表達(dá)改變?；蛐酒瑱z測(cè)共獲1 185個(gè)差異基因，ACAA2為其中之一，并且血根堿可顯著上調(diào)ACAA2基因表達(dá)豐度，這提示ACAA2可能為血根堿的一個(gè)靶基因，血根堿通過上調(diào)ACAA2而表達(dá)發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析軟件進(jìn)行卵巢癌中ACAA2相關(guān)信息的挖掘，我們發(fā)現(xiàn)ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)降低，且其表達(dá)水平與卵巢癌預(yù)后呈正相關(guān)。細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)初步證實(shí)，血根堿可能通過上調(diào)其表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，但后期仍需進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)深入探討其作用機(jī)理，為卵巢癌的診治提供新視角。

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