徐慧娟，張曉燕，夏 莉，王 菲

（1.瀚暉制藥有限公司，浙江 杭州 310020；2.杭州和澤醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 318000）

瑞舒伐他?。╮osuvastatin），其化學(xué)名為（E）-7-[4-（4-氟基苯基）-6-異丙基-2-[甲基（甲磺?；┌被鵠-嘧啶-5-基]（3R，5S）-3，5-二羥基庚-6-烯酸，CAS號(hào)：147098-20-2，分子式：C22H28N3O6S[1]。最早由日本鹽野義制藥公司研發(fā)，2003年在美國(guó)正式獲批上市，以鈣鹽給藥，是一種選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑，用于治療高脂血癥、高膽固醇血癥及動(dòng)脈硬化癥等相關(guān)疾病[2]。其結(jié)構(gòu)式中有兩個(gè)手性碳，貯藏期間可能轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體，瑞舒伐他汀鈣片剛被收載到USP41[3]中，該標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行控制，暫不確定對(duì)映異構(gòu)體是否有相同的臨床療效，因此參考EP9.0[4]瑞舒伐他汀鈣原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]建立瑞舒伐他汀鈣片對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)質(zhì)控方法具有研究意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

U3000高效液相色譜儀，戴安；MS105DU十萬(wàn)分之一電子天平，ME104E萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托力多；色譜柱CHIRALCEL OJ-RH（4.6×150mm，5μm），大賽璐；供試品：瑞舒伐他汀鈣片（批號(hào)：71705141，規(guī)格10mg），浙江海正藥業(yè)股份有限公司；對(duì)照品：瑞舒伐他汀鈣（批號(hào)：2.0），EP；對(duì)映異構(gòu)體（P1101-2），浙江海正藥業(yè)股份有限公司；非對(duì)映異構(gòu)體（批號(hào)：P1401-1），浙江海正藥業(yè)股份有限公司；氧化雜質(zhì)（批號(hào)：20-DEC-16-03），美國(guó)QTY；內(nèi)酯雜質(zhì)（批號(hào)：140421），加拿大MC；光降解雜質(zhì)S（批號(hào)：15-NOV-16-5），美國(guó)QTY；瑞舒伐他汀乙酯（批號(hào)：20170529 RE08），深圳博泰爾；乙腈（色譜純），默克；三氟醋酸（色譜純），美國(guó)天地有限公司；其他試驗(yàn)均為色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法

取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于瑞舒伐他汀25 mg），置25 mL量瓶中，加乙腈-水（25:75）超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品適量，用乙腈-水（25:75）稀釋制成每1 mL約含瑞舒伐他汀2 μg的對(duì)照品溶液；另取瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品與對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品各適量，加乙腈-水（25:75）溶解并稀釋制成每1 mL中約含瑞舒伐他汀1 mg，對(duì)映異構(gòu)體4 μg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。照高效液相色譜法（中國(guó)藥典 2015年版四部通則0512）試驗(yàn)，用CHIRALCEL OJ-RH纖維素衍生物手性柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-0.1%（V/V）三氟醋酸水溶液（25：75）為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.5 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm；柱溫35℃。 取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液10 μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為對(duì)映異構(gòu)體峰與瑞舒伐他汀峰，瑞舒伐他汀峰與對(duì)映異構(gòu)體峰之間的分離度應(yīng)不低于1.5，瑞舒伐他汀峰拖尾因子不得過(guò)1.8。分別精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10 μ1，分別注入液相色譜儀，供試品溶液色譜圖中如有與對(duì)映異構(gòu)體保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算不得過(guò)0.1%。

1.2.2 溶液配制

（1）稀釋劑：乙腈-水（25:75）

空白輔料溶液：稱(chēng)取空白輔料（總混）170 mg，置10 ml量瓶中，加稀釋劑超聲，放冷至室溫，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。

（2）供試品溶液：取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于瑞舒伐他汀25 mg），置25 ml量瓶中，加稀釋劑超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（3）對(duì)照品溶液：精密量取瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品10 mg，置100 ml量瓶中，用稀釋劑超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

（4）系統(tǒng)適用性溶液：稱(chēng)取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品4 mg，置50 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置20 ml量瓶中，稱(chēng)取瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品20 mg，置同一量瓶中，加稀釋劑超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（5）準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液①：精密稱(chēng)取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品10 mg，置100 ml量瓶中，加乙腈適量超聲使溶解，放冷至室溫，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。（0.1 mg/ml）

（6）準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液②：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液①5ml，置50 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。（10 μg/ml）

對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)限（LOD）儲(chǔ)備液：精密量取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液②1 ml，置10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

（7）LOD溶液：精密量取2 ml對(duì)映異構(gòu)體LOD儲(chǔ)備液、1.2 ml對(duì)照品溶液，置同一50 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

（8）定量限（LOQ）溶液：精密量取2 ml對(duì)映異構(gòu)體LOD儲(chǔ)備液、1.2 ml對(duì)照品溶液，置同一10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

12.4 空白試劑干擾試驗(yàn)

精密量取稀釋劑和空白輔料溶液各10 μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.4 已知雜質(zhì)干擾試驗(yàn)

加入有限度濃度的各已知雜質(zhì)（對(duì)映異構(gòu)體限度0.1%，非對(duì)映異構(gòu)體限度0.2%，氧化雜質(zhì)限度1.0%，光降解雜質(zhì)S限度0.2%，瑞舒伐他汀內(nèi)酯限度1.0%，瑞舒伐他汀乙酯限度0.2%）和瑞舒伐他汀鈣，配制成每ml含1 mg瑞舒伐他汀的混合溶液，精密量取10 μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液10 μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并連續(xù)測(cè)定對(duì)照品數(shù)次，計(jì)算峰面積的RSD%。

1.2.6 檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）

分別精密量取LOD和LOQ溶液10 μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.7 線性與范圍

（1）線性對(duì)照品儲(chǔ)備液①：取準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液①稀釋配制25 ml（0.1 mg/mL）。

（2）線性?xún)?chǔ)備液：精密量取對(duì)線性照品儲(chǔ)備液①瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 m L，置25 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。（20 μg/mL）

（3）線性溶液1（定量限）：精密量取以上線性?xún)?chǔ)備液適量，用稀釋劑制成定量限濃度，即得。

（4）線性溶液2（50%）、3（100%）、4（150%）、5（200%）：精密量取線性?xún)?chǔ)備液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL，分別置10 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，分別制成1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL。

精密量取上述線性溶液1～6（各1針）10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作線性回歸方程，并計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體的校正因子。

1.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

（1）定量限濃度溶液：稱(chēng)取空白輔料170 mg（處方量），置10 mL量瓶中，加稀釋劑適量，超聲使溶解，放冷至室溫，精密量取準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液②適量，置同一量瓶中，搖勻，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。（平行3份，各進(jìn)1針）

（2）50%限度溶液、100%限度溶液、150%限度溶液：稱(chēng)取空白輔料170 mg（處方量），置10 mL量瓶中，加稀釋劑適量，超聲使溶解，放冷至室溫，分別精密量取準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液；②1 mL、2 mL、3 mL，置同一量瓶中，搖勻，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。（最終濃度分別為1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL，每種濃度平行3份，各進(jìn)1針）

精密量取定量限濃度溶液、150%限度溶液、對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，通過(guò)理論加入量及實(shí)際測(cè)得量計(jì)算各濃度下的對(duì)映異構(gòu)體的回收率，并計(jì)算RSD%，考察方法的準(zhǔn)確度。

1.2.9 重復(fù)性（加樣）試驗(yàn)

加樣供試品溶液：稱(chēng)取本品研細(xì)粉末適量（約相當(dāng)于瑞舒伐他汀10 mg），置10 mL量瓶中，加稀釋劑適量，超聲使溶解，放冷至室溫，精密量取準(zhǔn)確度對(duì)照品儲(chǔ)備液；②2 mL，置同一量瓶中，搖勻，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。（平行配制6份）

精密量取上述加樣供試品溶液（6份，各1針）10 μl注入液相色譜儀，按主成分外標(biāo)法以峰面積計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體含量及RSD%。

1.2.10 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液、供試品溶液、加樣供試品溶液三者置室溫（15℃～25℃）避光放置，約在0、12、24、48、72小時(shí)，分別精密量取以上3個(gè)溶液10 μl，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)與0小時(shí)峰面積的比值。

1.2.11 色譜條件耐用性試驗(yàn)

對(duì)色譜條件分別做如下變動(dòng)考察：（1）流動(dòng)相組成-有機(jī)相比例±2%，即（0.1%三氟醋酸水溶液-乙腈（77:23）和（73:27）；（2）柱溫（35±2℃）；（3）流速（0.5±0.1 mL/min）；（4）同型號(hào)其他色譜柱。

2 結(jié)果與討論

2.1 空白試劑、空白輔料干擾試驗(yàn)

圖1顯示空白試劑不干擾樣品檢測(cè)，空白輔料出峰時(shí)間約為主峰的相對(duì)保留時(shí)間1.8，對(duì)其無(wú)干擾，專(zhuān)屬性好。

圖1 空白輔料、空白溶劑、系統(tǒng)適用性、對(duì)照品溶液圖譜

2.2 已知雜質(zhì)干擾試驗(yàn)

圖2顯示各已知雜質(zhì)限度濃度下的液相圖，各已知雜質(zhì)出峰在主峰后，對(duì)映異構(gòu)體在主峰前，因此各已知雜質(zhì)不干擾檢測(cè)。

圖2 各已知雜質(zhì)定位圖

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

表1表明，瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品5次進(jìn)樣峰面積的RSD%小于1，系統(tǒng)適用性符合要求。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.4 線性和范圍

線性和范圍結(jié)果見(jiàn)表2，相關(guān)系數(shù)、截距均符合要求，校正因子為1.09；可不予校正。

2.5 檢測(cè)限與定量限

當(dāng)對(duì)映異構(gòu)體和瑞舒伐他汀對(duì)照品濃度低至0.04 μg/mL（即含量0.004%）時(shí)，兩物質(zhì)的吸收峰信噪比均不3.2，大于3，符合檢測(cè)限要求。

表3表明本品中對(duì)映異構(gòu)體含量低至0.02%時(shí)可有效定量，信噪比大于10。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

表4表明，定量限濃度下回收率為91.1%，其他濃度下回收率平均值為93.3%，本方法準(zhǔn)確度良好。

表2 線性與范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

加入量為0.02004mg，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，回收率分別是107.7%、108.0%、108.6%、107.6%、108.0%、107.5%，平均回收率為107.9%，RSD%為0.36%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

表5表明瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品溶液、供試品（加樣）溶液在室溫（15-25℃）條件下72小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

表5 對(duì)照品溶液、供試品（加樣）溶液中對(duì)映異構(gòu)體穩(wěn)定性

2.9 色譜條件耐用性試驗(yàn)

表6表明在各條件下系統(tǒng)適用性結(jié)果均符合要求；每個(gè)色譜條件下的測(cè)定結(jié)果與原條件測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值均不大于0.05%；但需注意的有機(jī)相比例變化2%，保留時(shí)間的影響很大，需注意控制有機(jī)相比例。

表6 色譜條件耐用性對(duì)映異構(gòu)體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

空白試驗(yàn)和空白輔料不干擾樣品檢測(cè)。對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫條件下72小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

耐用性主要考察方法本身對(duì)于可變?cè)囼?yàn)因素的抗干擾能力，分別考察柱溫37℃和33℃，流速0.6 ml/min和0.4 ml/min，有機(jī)相比例23%和27%，測(cè)定同一批樣品，結(jié)果顯示有機(jī)相比例的輕微改變引起瑞舒伐他汀鈣和對(duì)映異構(gòu)體保留時(shí)間較大漂移，日常檢測(cè)時(shí)需注意。其他條件的輕微改變對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備10%、50%、100%、150%濃度的供試品溶液，考察峰面積與溶液中瑞舒伐他汀和對(duì)映異構(gòu)體濃度的線性關(guān)系，瑞舒伐他汀在濃度為0.2352 μg/mL-3.920μg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積成線性，線性方程為y=835.8735x+0.0070，r為0.99995，響應(yīng)因子的RSD為2.51%，截距為100%響應(yīng)值的0.4%。對(duì)映異構(gòu)體在濃度為0.2004～4.008 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積成線性，線性方程為y=764.9376x+0.0047，r為0.9999，響應(yīng)因子的RSD為3.38%，截距為100%響應(yīng)值的0.3%，校正因子為1.09；可不予校正。表明在上述濃度范圍內(nèi)瑞舒伐他汀鈣和對(duì)映異構(gòu)體線性關(guān)系良好。

本文通過(guò)對(duì)瑞舒伐他汀對(duì)映異構(gòu)體分析方法的驗(yàn)證，確定了此方法的合理性、有效性，對(duì)瑞舒伐他汀鈣片的質(zhì)量監(jiān)控提供方法。