吳粵 孫媛媛 王嵐 趙勤華 宮素崗 袁平 劉錦銘

1同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科200433；2同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院肺循環(huán)科200433

特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓 (idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)是由多種因素引起肺小血管重構(gòu),肺循環(huán)阻力進(jìn)行性增高,右心負(fù)荷增加進(jìn)而導(dǎo)致右心衰竭致患者死亡的惡性心血管疾病[1]。確診IPAH 的金標(biāo)準(zhǔn)是右心導(dǎo)管檢查(right heart catheterization,RHC),其多項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)如肺血管阻力 (pulmonary vascular resistance,PVR)是評(píng)價(jià)預(yù)后的重要因素[2]。近年來(lái)許多研究表明微小 RNA (microRNA,miRNA)在IPAH 疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-548 或其他亞型可以參與多種疾病的免疫反應(yīng)[4-5],但miRNA-548a-5p在IPAH 的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)篩選出IPAH 患者和健康人群的血漿中差異表達(dá)的miRNA,觀察其表達(dá)量和患者的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)相關(guān)性,探討血漿miRNA 是否可以作為預(yù)測(cè)患者血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)惡化的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究回顧性地納入了從2010年5月至2017年6 月入住上海市肺科醫(yī)院的IPAH患者和健康對(duì)照人群各12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)RHC明確診斷。入選標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)[6]：靜息狀態(tài)下,平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kpa),肺小動(dòng)脈楔壓 (pulmonary arterial wedge pressure,PAWP)≤15 mm Hg。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他類(lèi)型的肺動(dòng)脈高壓患者,如慢性血栓性肺動(dòng)脈高壓、左心疾病及呼吸系統(tǒng)疾病引起的肺動(dòng)脈高壓;排除合并有其他肺部疾病的患者;排除患有影響激素代謝的慢性或急性疾病的患者;排除正在使用或既往使用過(guò)激素藥物及影響激素的藥物的患者;排除神經(jīng)精神疾病的患者。對(duì)照組人群是疑似IPAH 患者,經(jīng)RHC 明確排除IPAH,且無(wú)其他慢性疾病的相對(duì)健康的人群。

該研究經(jīng)上海市肺科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(K19-069Y)。所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料 記錄IPAH 患者和對(duì)照組人群的年齡、身高、體質(zhì)量,并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI),比較2組基線資料的差異。同時(shí)收集患者的相關(guān)臨床參數(shù),包括：世界衛(wèi)生組織心功能分級(jí) (World Health Organization functional class,WHO-FC)、6 分鐘步行距離、氨基末端腦利鈉肽前體等。

1.2.2 主要檢測(cè)參數(shù) 右心導(dǎo)管參數(shù)包括平均右心房壓 (mean right atrial pressure,m RAP)、mPAP、PAWP、 心輸出量 (cardiac output,CO)、 肺 血 管 阻 力 (pulmonary vascular resistance,PVR)等。

1.2.3 miRNA 提取及芯片檢測(cè) 抽取每例患者外周抗凝血約4 ml,以3 000 r/min (離心半徑10 cm)離心5 min分離得血漿標(biāo)本。按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA,并用miRNeasy提取試劑盒 (QIAGEN)提取miRNA。應(yīng)用NanoDrop 1000檢測(cè)RNA 純度及質(zhì)量。采用丹麥EXiqon公司生產(chǎn)的18.0版miRCURYTMLNA 芯片。芯片篩選2 組間差異表達(dá)的 miRNA 分子,并用Targetscan、Miranda和Pictar等靶基因軟件預(yù)測(cè)其靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量用±s 表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);分類(lèi)變量采用構(gòu)成比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。采用線性回歸及多重線性回歸分析預(yù)測(cè)因子。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2組間一般情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患者的WHO-FC、6分鐘步行距離及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)m RAP、mPAP、PAWP、PVR、CO 等見(jiàn)表1。

2.2 miRNA 檢測(cè)結(jié)果 IPAH 患者與對(duì)照組血漿中miRNA 芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,滿足Fold change≥2,且P ＜0.05條件的差異miRNA 有797個(gè)上調(diào),有42個(gè)下調(diào),其中miRNA-548a-5p表達(dá)差異最顯著,因此選擇miRNA-548a-5p 進(jìn)行后續(xù)的研究。IPAH 組miRNA-548a-5p表達(dá)明顯高于對(duì)照組(t=3.038,P ＜0.05);IPAH 組男性患者的miRNA-548a-5p表達(dá)水平高于對(duì)照組男性 (t=2.466,P ＜0.05);IPAH 組 女 性 患 者miRNA-548a-5p表達(dá)水平與對(duì)照組女性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 2組患者的一般資料比較

2.3 miRNA-548a-5p表達(dá)與血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性 在IPAH 患者的miRNA-548a-5p表達(dá)量和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析中,miRNA-548a-5p表達(dá)量分別與m RAP、m PAP、PAWP和PVR 呈輕到中度正相關(guān) (r 值分別為0.477、0.616、0.607、0.517,P 值均＜0.05),但是與CO 及心指數(shù)未見(jiàn)顯著相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 IPAH 患者miRNA-548a-5p與血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

2.4 miRNA-548a-5p對(duì)血流動(dòng)力學(xué)惡化的預(yù)測(cè)情況 將miRNA-548a-5p 表達(dá)量作為自變量,和miRNA-548a-5p表達(dá)量相關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)mPAP、PVR 分別作為因變量,采用線性回歸及逐步多重線性回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有IPAH 患者中,校正了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)和WHO-FC 后,miRNA-548a-5p表達(dá)升高可作為mPAP、PVR 升高的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。見(jiàn)表3、4。

表3 單因素線性回歸分析miRNA-548a-5p預(yù)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)升高的情況

表4 多重線性回歸分析miRNA-548a-5p預(yù)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)升高的情況

2.5 miRNA-548a-5p 的受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析結(jié)果 為更進(jìn)一步探討差異化表達(dá)miRNA-548a-5p的意義,本文采用了ROC 曲線分析方法測(cè)試了miRNA-548a-5p對(duì)IPAH 組和對(duì)照組的鑒別效能。結(jié)果得出,ROC 曲線下面積為0.799。通過(guò)最佳臨界值分析得出,miRNA-548a-5p的敏感度為91.7%,特異度為66.7%。臨界值為10.5 (表5)。血漿miRNA-548a-5p高表達(dá)組血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)m RAP、mPAP、PAWP 和PVR均高于miRNA-548a-5p 低表達(dá)組 (t 值分別為1.969、3.010、1.861、2.250,P 值均＜0.05)(表6)。

3 討論

miRNA 作為近年來(lái)較為成熟的分子標(biāo)志物,其表達(dá)會(huì)受到人體各種生理病理變化的影響。本研究證實(shí),IPAH 患者血漿中miRNA-548a-5p 的表達(dá)顯著升高,并首次證明其表達(dá)量還可以獨(dú)立預(yù)測(cè)m PAP和PVR 的升高。

最近研究表明,患者血漿中多項(xiàng)miRNA 表達(dá)對(duì)肺動(dòng)脈高壓的診斷和預(yù)后分析都有很大的價(jià)值[7]。Kheyfets等[8]通過(guò)檢測(cè)14例兒童肺動(dòng)脈高壓患者血漿中miRNA 表達(dá)的變化,之后通過(guò)PCR技術(shù)水平驗(yàn)證,找到了32個(gè)循環(huán)的miRNA 和肺血管功能相關(guān)參數(shù)有相關(guān)性,這些miRNA 是預(yù)測(cè)兒童肺動(dòng)脈高壓患者的血管功能標(biāo)志物。也有學(xué)者證明miRNA-150水平是獨(dú)立于年齡、6分鐘步行距離、病程、紅細(xì)胞分布寬度等多項(xiàng)指標(biāo)的肺動(dòng)脈高壓預(yù)后標(biāo)志物[9]。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)在左心疾病相關(guān)肺動(dòng)脈高壓人群中,miRNA-206和肺動(dòng)脈收縮壓呈顯著相關(guān)性,說(shuō)明其可以預(yù)測(cè)此部分人群的疾病嚴(yán)重程度。Sarrion等[11]選取了12例患者和10名健康者進(jìn)行對(duì)照,發(fā)現(xiàn)了61 個(gè)差異顯著的miRNA,尤其是 miRNA-23a,作者不僅發(fā)現(xiàn)miRNA-23a和肺功能具有相關(guān)性,還通過(guò)沉默miRNA-23a發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了下游PGC1α的表達(dá)。

本 研 究 主 要 發(fā) 現(xiàn),IPAH 患 者 中miRNA-548a-5p表達(dá)明顯上調(diào),這提示血漿中miRNA-548a-5p可能參與了患者的疾病進(jìn)展,進(jìn)而導(dǎo)致患者和健康人群血漿中miRNA-548a-5p表達(dá)差異顯著。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于miRNA-548a-5p在肺動(dòng)脈高壓患者中表達(dá)水平罕有報(bào)道,筆者只是觀察到miRNA-548a-5p在IPAH 患者血漿中表達(dá)明顯上調(diào),其在肺組織和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)以及對(duì)肺動(dòng)脈高壓疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制仍需后續(xù)深入實(shí)驗(yàn)加以明確。

影響IPAH 患者預(yù)后的因素很多,PVR 是反映IPAH 患者疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo),受PAWP、mPAP及CO 的影響 [PVR= (m PAPPAWP)/CO][12],PVR 升高會(huì)限制右心室射血入肺動(dòng)脈,從而影響肺血流的灌注和全身血液的供應(yīng)。本研究的線性回歸模型提示miRNA-548a-5p的表達(dá)量是預(yù)測(cè)PVR 和m PAP 升高的獨(dú)立指標(biāo),ROC曲線分析表明,ROC 曲線下面積為0.799,通過(guò)最佳臨界值分析得出,miRNA-548a-5p 的敏感度 為91.7%, 特 異 度 為66.7%, 說(shuō) 明miRNA-548a-5p在診斷IPAH 可能具有較高的敏感性和特異性。

綜上所述,本研究結(jié)果提示IPAH 患者較對(duì)照人群的miRNA-548a-5p表達(dá)顯著升高,并顯示miRNA-548a-5p是預(yù)測(cè)患者mPAP 和PVR 升高的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,可以為臨床診斷和判斷IPAH患者疾病惡性程度提供參考。

表5 多重線性回歸分析miRNA-548a-5p預(yù)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)升高的情況

表6 按照miRNA-548a-5p的臨界值分組后2組血流動(dòng)力學(xué)差異情況 (±s)

表6 按照miRNA-548a-5p的臨界值分組后2組血流動(dòng)力學(xué)差異情況 (±s)

注：1 mm Hg=0.133 k Pa

組別例數(shù)平均右心房壓(mm Hg)平均肺動(dòng)脈壓(mm Hg)肺小動(dòng)脈楔壓(mm Hg)肺血管阻力(Wood units)心輸出量(L/min)心指數(shù)(L·min-1·m-2)miR-548a-5P ＜10.5 8 1.6±1.1 15.9±9.9 5.3±1.8 2.6±2.4 6.6±2.5 3.9±1.5 miR-548a-5p≥10.5 16 5.3±5.1 52.3±33.1 8.0±3.9 10.6±9.1 5.2±1.9 3.2±1.2 t 值1.969 3.010 1.861 2.250-1.508-1.287 P 值0.018 0.001 0.048 0.016 0.146 0.212

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突