陳欣欣 周紅霞 李潤(rùn)峰 江海明 邱健健 李文佳 姜志宏 鐘南山楊子峰

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣州呼吸健康研究院 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心510000；2廣東東陽光藥業(yè)有限公司國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室,東莞523850

COPD 是一種以呼吸系統(tǒng)持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病,是僅次于高血壓、糖尿病的中國(guó)第三大常見慢性病[1]。目前我國(guó)COPD患者人數(shù)約占全世界COPD 患者人數(shù)的25%[1]。香煙暴露是COPD 重要的危險(xiǎn)因素,在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2]。香煙暴露引起氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[3],在此基礎(chǔ)上感染細(xì)菌或病毒易引起急性加重,進(jìn)一步促發(fā)更劇烈的炎癥反應(yīng)[4]。因此,抗炎是COPD 治療必不可少的環(huán)節(jié)。目前抗炎藥主要有吸入性糖皮質(zhì)激素和磷酸二酯酶4抑制劑,有較好的療效,但并未能完全逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展以及有效降低患者肺功能的年遞減率,且有一定的不良反應(yīng),故需要尋求可長(zhǎng)期使用且安全有效的新抗炎藥。

本研究用人支氣管上皮細(xì)胞 (human bronchial epithelial cell,16 HBE)和單核巨噬細(xì)胞 [佛波酯誘導(dǎo)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(human acute monocytic leukemia cell,THP-1)貼壁]建立了香煙提取物 (cigarette smoke extraction,CSE)單一刺激或CSE 刺激后感染流感病毒的炎癥因子表達(dá)模型,分別觀察鮮冬蟲夏草冷水提取物對(duì)炎癥因子表達(dá)的抑制活性以及對(duì)黏液蛋白5AC (mucin 5AC,MUC5AC)高表達(dá)的抑制作用,從固有免疫反應(yīng)角度闡明冬蟲夏草提取物在體外治療呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病的藥理活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 鮮冬蟲夏草冷水提取物由廣東東陽光藥業(yè)有限公司提供。將適量鮮冬蟲夏草在冰浴下勻漿5 min,在冰上超聲30 min,-20 ℃冷凍1 h后,再次勻漿5 min,4 ℃下,以離心半徑6 cm、5 500 r/min離心10 min,取上清液,將上清液冷凍干燥,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)試劑盒 (貨號(hào)20180518,南京建成生物科技有限公司)、苯酚 (貨號(hào)131714020,Aladdin)、RPMI 1640 basic(1×)培養(yǎng)基 (貨號(hào)C11875500BT,美國(guó)Gibco 公司)、DMEM basic(1×)培養(yǎng)基 (貨號(hào)C11995500BT,美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清 (貨號(hào)10270-106,美國(guó)Gibco 公司)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(貨號(hào)C10010500BT,美國(guó)Gibco公司)、0.25%-乙二胺四乙酸胰酶 (貨號(hào)25200-056,美國(guó)Gibco公司)、CCK-8 (貨號(hào)CK04,日本東仁化學(xué)試劑研究所)、佛波酯 (貨號(hào)1002511716,美國(guó)Sigma 公司)、RNA 提取試劑盒 (貨號(hào)RC101-0150 rxn,南京諾唯贊生物科技有限公司)、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (貨號(hào) RR036A-1, 日本 Ta KaRa 公司)、PREmix Ex TaqTM(Probe qPCR)PCR 擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)RR390,日本Ta KaRa 公司)、Millicell EZ SLIDE 8-well玻片 (貨號(hào)PEZGS0816,美國(guó)Millicell公司);4%多聚甲醛 (貨號(hào)DF0135,捷倍斯生物科技有限公司);Triton-X100 (貨號(hào)0694,捷倍斯生物科技有限公司);熒光放大系統(tǒng)試劑盒VectaFluor Antibody Kit Dy Light 488 (貨號(hào)DK-2488,美國(guó)Vectorlab公司);Anti-MUC5AC抗體 (貨號(hào)ab77576,美國(guó)Abcam 公司),DAPI抗熒光淬滅劑(貨號(hào)P36935,美國(guó)Invitrogen公司)。

1.1.3 病毒與細(xì)胞 甲型流感病毒 [A/PR8/34(H1N1)]、狗腎上皮細(xì)胞、16 HBE 和THP-1均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 藥物不同成分的含量及酶活性測(cè)定 紫外高效液相色譜法分析樣品核苷特征圖譜,硫酸-苯酚法檢測(cè)樣品總糖含量,SOD 試劑盒檢測(cè)樣品SOD 活力。

1.2.2 CSE制備 將去掉過濾嘴的香煙點(diǎn)燃,用氣體采樣管(大包氏管)采集香煙主流煙霧,2個(gè)串聯(lián)的大包氏管內(nèi)各裝有5 ml無血清的DMEM 培養(yǎng)基作為吸收液,一端連接香煙,另一端連接50 ml注射器,以50 ml/min的速度吸煙2支,每支煙吸10 次,然后將該溶液p H 值調(diào)整為7.40,并用直徑為0.20μm 濾膜過濾,去除細(xì)菌和顆粒,該溶液為100%CSE[5]。

1.2.3 CSE 的細(xì)胞毒性測(cè)定 16HBE 于96孔板長(zhǎng)至70%后進(jìn)行饑餓處理,用無血清的培養(yǎng)基孵育24 h后,加入不同濃度梯度的CSE (0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%),每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,48 h后每孔加10μl CCK-8溶液,作用2 h后測(cè)定OD450值。96孔板每孔加入3×104個(gè)THP-1 細(xì)胞,用100μg/L 的PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,24 h后用PBS 洗2 次,每孔加RPMI1640培養(yǎng)基100μl繼續(xù)孵育24 h,然后加入相同梯度濃度的CSE,24 h后測(cè)定OD450值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度 (50%toxic concentration,TC50)。

1.2.4 藥物的細(xì)胞毒性測(cè)定 藥物從8 000 mg/L倍比稀釋為7個(gè)濃度的含藥溶液,加入96孔板的16 HBE和THP-1細(xì)胞中,每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔,孵育24 h (THP-1細(xì)胞)和48 h (16HBE 細(xì)胞)后每孔加10μl CCK-8溶液,作用2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

1.3 鮮冬蟲夏草體外抗炎作用

1.3.1 CSE 誘導(dǎo)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的炎癥因子檢測(cè) 16HBE以2×105個(gè)/ml的密度鋪于12孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%的時(shí)候饑餓處理24 h,用3%CSE刺激12、24、48 h,提取核酸樣本,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 檢測(cè)炎癥介質(zhì)mRNA 表達(dá)。在12孔板中,用100μg/L PMA 誘導(dǎo)THP-1 (1×105個(gè)/ml)分化成貼壁細(xì)胞,作用24 h后用PBS洗2次,加入DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用3%的CSE刺激4、8、12 h,提取核酸,用qPCR 方法檢測(cè)炎癥介質(zhì)m RNA 表達(dá)。

1.3.2 藥物對(duì)CSE誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的抑制作用 使用與1.3.1相同的方法造模,16 HBE 細(xì)胞刺激48 h,THP-1細(xì)胞刺激8 h,CSE刺激的同時(shí)加入1 000、500、250 mg/L鮮冬蟲夏草水提取物,提取核酸,用qPCR 檢測(cè)炎癥因子m RNA 表達(dá)。

1.3.3 藥物對(duì)CSE刺激后感染H1N1流感病毒的抗炎作用 12孔板單層16HBE細(xì)胞饑餓24 h,分為7個(gè)組,方法見表1。

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后,提取核酸,用qPCR 方法檢測(cè)炎癥因子m RNA 表達(dá)。各種炎癥介質(zhì)引物探針 (表2)由華大基因生物有限公司合成。

1.3.4 CSE 誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MUC5AC 的免疫熒光實(shí)驗(yàn) 16HBE 細(xì)胞消化后均勻鋪于8 孔玻片中,培養(yǎng)24 h后,饑餓處理24 h,饑餓后,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)置,1 000 mg/L 和500 mg/L 的藥物與CSE 共同加入細(xì)胞中,37 ℃孵育48 h,取出8 孔玻片,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定15 min后PBS沖洗3次,每次5 min,0.3% Triton-X100 透化3 min,PBS沖洗3次,每次5 min,2.5%馬血清,37 ℃封閉20 min,PBS 沖洗后加入MUC5AC 一抗(1∶100),4℃過夜,PBS沖洗3次,每次5 min,用熒光放大系統(tǒng)試劑盒,按照說明書,每孔中的玻片上滴加200μl二抗,37 ℃孵育15 min,PBS沖洗3 次,每次5 min,沖洗后每孔加入200 μl Dy Light-488試劑孵育30 min,PBS沖洗3次,每次5 min,滴加抗熒光淬滅劑,封片,置于鏡下觀察。

表1 藥物對(duì)CSE刺激后感染H1N1流感病毒的抗炎作用實(shí)驗(yàn)方法

表2 炎癥介質(zhì)各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 藥物不同成分的含量和酶活性 結(jié)果顯示,鮮冬蟲夏草水提取物的總核苷含量為0.423%,總糖含量為18.69%,SOD 活力為14 736.5 U/ml。

2.2 藥物的細(xì)胞毒性 CCK-8法測(cè)定鮮冬蟲夏草冷水提取物對(duì)16 HBE 細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的TC50分別為4 677.35 mg/L 和5 520.77 mg/L。結(jié)合顯微鏡觀察,1 000 mg/L 鮮冬蟲夏草冷水提取物處理的2種細(xì)胞病變明顯,與正常對(duì)照組形態(tài)相同,故確定此濃度為后續(xù)藥效實(shí)驗(yàn)的最高允許濃度。

2.3 CSE刺激誘導(dǎo)16HBE 和THP-1細(xì)胞的炎癥因子表達(dá) CCK-8染色顯示,CSE 對(duì)16HBE 細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的無毒濃度為2.2%。用3%CSE 刺激2 種細(xì)胞,不同時(shí)間點(diǎn) (16HBE：12、24、48 h;THP-1：4、8、12 h)測(cè)定炎癥因子m RNA表達(dá)水平。結(jié)果表明,16HBE 細(xì)胞的IL-6、IL-8和MUC5AC的m RNA 表達(dá)高峰出現(xiàn)在CSE 刺激后48 h,而THP-1細(xì)胞的腫瘤壞死因子α、IL-1β、IL-6和IL-8表達(dá)高峰在刺激后8 h。據(jù)此,確定藥物在16HBE細(xì)胞的抗炎活性檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為CSE刺激后48 h,THP-1 細(xì)胞的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為刺激后8 h。

2.4 藥物在單一CSE刺激氣道上皮和單核巨噬細(xì)胞模型的抗炎活性 與CSE 刺激組比較,1 000 mg/L和500 mg/L 藥物對(duì)CSE 刺激16 HBE細(xì)胞48 h引起IL-6的m RNA 表達(dá)有明顯抑制活性(t 值分別為6.514、5.156,P 值均＜0.05);1 000 mg/L藥物對(duì)CSE刺激16HBE 細(xì)胞48 h引起IL-8 的m RNA 表達(dá)有明顯抑制活性 (t =4.304,P ＜0.05); 各劑量 (1 000、500、250 mg/L)藥物顯著抑制了MUC5AC 的m RNA表達(dá) (t 值分別為8.922、5.796、7.842,P 值均＜0.05)。見表3。

各劑量 (1 000、500、250 mg/L)對(duì)CSE 刺激THP-1細(xì)胞8 h引起腫瘤壞死因子α的表達(dá)有明顯抑制作用(t值分別為9.549、9.616、8.573,P 值均＜0.05),對(duì)IL-6的表達(dá)亦有抑制作用 (t值分別為4.458、5.399、4.151,P 值均＜0.05),1 000 mg/L和500 mg/L藥物組的IL-1β表達(dá)明顯低于CSE刺激組(t值分別為7.237、6.020,P 值均＜0.05),250 mg/L劑量對(duì)IL-1β表達(dá)無明顯影響(P ＞0.05)。見表4。

表3 香煙提取物刺激16HBE細(xì)胞和不同濃度的藥物干預(yù)組的細(xì)胞因子m RNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

表3 香煙提取物刺激16HBE細(xì)胞和不同濃度的藥物干預(yù)組的細(xì)胞因子m RNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

注：MUC5AC為黏液蛋白5AC;與香煙提取物刺激組比較,a P ＜0.05

組別例數(shù)IL-6 IL-8 MUC5AC香煙提取物刺激組3 13.35±2.06 5.343±0.96 6.497±0.73低劑量蟲草干預(yù)組3 11.65±3.17 5.469±0.70 1.823±0.72a中劑量蟲草干預(yù)組3 6.54±0.99a 2.288±0.88 2.358±0.10a高劑量蟲草干預(yù)組3 4.72±1.01a 2.063±0.90a 1.448±0.65a F 值12.34 13.92 26.51 P 值0.0135 0.0018 0.0003

表4 香煙提取物刺激THP-1細(xì)胞和不同濃度的藥物干預(yù)組的細(xì)胞因子m RNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

表4 香煙提取物刺激THP-1細(xì)胞和不同濃度的藥物干預(yù)組的細(xì)胞因子m RNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α;與香煙提取物刺激組比較,a P ＜0.05

組別例數(shù)TNF-αIL-1βIL-6 IL-8香煙提取物刺激組3 15.50±2.02 6.04±0.89 4.93±1.02 2.40±1.11低劑量蟲草干預(yù)組3 3.45±1.40a 3.65±1.25 1.72±0.87a 1.66±0.76中劑量蟲草干預(yù)組3 2.78±1.12a 1.80±0.83a 1.09±0.69a 1.15±0.61高劑量蟲草干預(yù)組3 1.86±1.46a 1.59±0.59a 1.51±0.84a 0.62±0.24 F 值53.57 15.08 12.54 3.069 P 值＜0.0001 0.0029 0.0027 0.1290

2.5 藥物在CSE刺激氣道上皮后感染流感病毒的抗炎活性 與單一感染H1N1流感病毒相比,CSE刺激16 HBE 細(xì)胞48 h 后再感染H1N1 (CSE+H1N1組)誘導(dǎo)的IL-8和干擾素βmRNA 表達(dá)水平均顯著升高(t值分別為6.567、13.21,P 值均＜0.05),且高于單一CSE與單一流感引起炎癥介質(zhì)表達(dá)水平之和,表明CSE 與H1N1流感感染具有協(xié)同促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的作用。與CSE+H1N1組比較,各濃度 (1 000、500、250 mg/L)藥物均明顯抑制了IL-8 m RNA 的表達(dá) (t 值分別為8.970、6.800、5.302,P 值均＜0.05)和干擾素β m RNA 的表達(dá) (t 值分別為23.46、22.12、17.53,P 值均＜0.05);1 000 mg/L 藥物組明顯抑制IL-6 m RNA 表達(dá) (t=5.860,P ＜0.05)。見表5。

2.6 藥物對(duì)CSE 刺激氣道上皮細(xì)胞表達(dá)MUC5AC的影響 正常16HBE 細(xì)胞的胞核及胞漿表達(dá)較弱的MUC5AC 熒光,3%CSE 刺激48 h后,MUC5AC表達(dá)明顯增強(qiáng)。1 000 mg/L藥物干預(yù)后,MUC5AC 熒光集中在胞核及其鄰近區(qū)域,胞漿表達(dá)明顯減少。1 000 mg/L 藥物干預(yù)組明顯比3%CSE 刺激組的綠色熒光強(qiáng)度弱,500 mg/L藥物干預(yù)組的綠色熒光強(qiáng)度與3% CSE 刺激組接近。見圖1。

3 討論

冬蟲夏草多糖已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用[7],是冬蟲夏草活性成分之一。SOD 可高效催化超氧化物自由基分解,清除氧自由基,對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)研究結(jié)果證實(shí)鮮冬蟲夏草中的SOD 活性最高,約為60 ℃烘干冬蟲夏草的3倍[8],揭示了低溫化提取或服用有利于保留SOD等活性成分。鮮冬蟲夏草冷水提取物總糖含量(18.69%)和SOD 活力 (14 736.5 U/ml)較高,有利于發(fā)揮抗炎抗氧化藥理活性。

香煙暴露刺激上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì),本研究構(gòu)建了CSE誘導(dǎo)局部氣道上皮細(xì)胞(16HBE 細(xì)胞,暴露48 h)和固有免疫細(xì)胞(THP-1細(xì)胞,暴露8 h)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞模型,評(píng)價(jià)鮮冬蟲夏草冷水提取物的抗炎活性。

表5 各組細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

表5 各組細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量 (±s)

注：IFN-β為干擾素β;與流感病毒刺激組比較,a P ＜0.05;與香煙提取物+流感病毒刺激組比較,b P ＜0.05

組別例數(shù)IL-6 IL-8 IFN-β香煙提取物刺激組3 1.85±0.42 1.59±0.18 2.01±0.21流感病毒刺激組3 9.19±1.82 12.74±1.46 354.63±32.08香煙提取物+流感病毒刺激組3 12.55±2.31 27.19±3.52a 776.91±45.13a低劑量蟲草干預(yù)組3 8.50±1.53 14.07±2.45b 238.85±28.07b中劑量蟲草干預(yù)組3 4.55±1.41 11.19±2.06b 130.95±22.81b高劑量蟲草干預(yù)組3 3.75±1.21b 7.66±1.36b 107.99±20.06b F 值21.32 48.90 288.2 P 值0.0002＜0.0001＜0.0001

圖1 鮮冬蟲夏草冷水提取物對(duì)CSE誘導(dǎo)16HBE表達(dá)MUC5AC免疫熒光的抑制作用

在單一CSE 刺激的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步增加了流感病毒感染的因素,因?yàn)楦腥驹贑OPD 發(fā)病和臨床轉(zhuǎn)歸中起重要作用,接近50%的COPD 急性加重與病毒感染有關(guān),其中流感病毒占7.83%[9]。本研究發(fā)現(xiàn)鮮冬蟲夏草冷水提取物對(duì)CSE 復(fù)合流感病毒感染引起的炎癥介質(zhì)m RNA 表達(dá)均有顯著的抑制活性,高濃度藥物的炎癥介質(zhì)表達(dá)低于單一感染流感的表達(dá),說明冬蟲夏草對(duì)CSE 與流感病毒感染協(xié)同促進(jìn)炎癥反應(yīng)具有較好抑制活性。

黏液高分泌是COPD 的重要病理生理特征。本文構(gòu)建了CSE 刺激16HBE 細(xì)胞引起MUC5AC高分泌的模型,從m RNA 表達(dá)水平和免疫熒光發(fā)現(xiàn)MUC5AC表達(dá)高峰出現(xiàn)在刺激后48 h,選擇此時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行藥效觀察。結(jié)果顯示,鮮冬蟲夏草冷水提取物可顯著抑制CSE 誘導(dǎo)的MUC5AC 高分泌。冬蟲夏草對(duì)COPD 氣道黏液高分泌的抑制活性有待進(jìn)一步在動(dòng)物模型進(jìn)而在COPD 患者來源的原代細(xì)胞模型中得到證實(shí)。

本研究存在以下局限性：(1)鮮冬蟲夏草冷水提取物的抗炎效應(yīng)局限在m RNA 水平,需進(jìn)一步在蛋白水平展開評(píng)價(jià); (2)本研究選用了非Th2型細(xì)胞因子作為抗炎評(píng)價(jià)指標(biāo),而Th2型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5 和IL-13 等)同樣也是COPD治療的重要指標(biāo)[10],需據(jù)此進(jìn)一步拓展鮮冬蟲夏草冷水提取物的抗炎癥因子譜;(3)本文已發(fā)現(xiàn)鮮冬蟲夏草冷水提取物對(duì)CSE 刺激致MUC5AC 高分泌有抑制作用,對(duì)CSE 刺激后感染流感的藥效尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究首先發(fā)現(xiàn)了鮮冬蟲夏草冷水提取物可有效抑制CSE 單一刺激或復(fù)合流感病毒感染誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng),并且在CSE刺激的THP-1細(xì)胞炎癥模型中兼具抗炎活性。其次,鮮冬蟲夏草冷水提取物可顯著抑制CSE 刺激氣道上皮細(xì)胞的MUC5AC高分泌。本研究揭示了冬蟲夏草兼具潛在治療COPD 炎癥和黏液高分泌兩大病理生理特征的藥用特色,比單一靶點(diǎn)藥物藥效更全面,值得進(jìn)一步在動(dòng)物模型開展藥效確認(rèn)和機(jī)制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突