楊紅嬌 董昭興 王穎 李建波 劉瑤瑤

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科650101

結(jié)締組織病 (connective tissue disease,CTD)是一種主要侵犯全身結(jié)締組織和血管的自身免疫性疾病,常累及全身多個(gè)臟器系統(tǒng),肺是最易受累的器官之一。間質(zhì)性肺疾病 (interstitial lung disease,ILD)是CTD 最常見的肺臟受累表現(xiàn)[1]。約20% ～45% 的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-3]、15.6%的原發(fā)性干燥綜合征[4]和20%～75%的多發(fā)性肌炎/皮肌炎[5-7]患者可發(fā)生ILD。雖然與特發(fā)性間質(zhì)性肺炎相比,CTD-ILD 的預(yù)后相對(duì)較好,免疫抑制劑對(duì)部分患者有一定效果[2],但I(xiàn)LD 仍是CTD 患者死亡的主要原因[8],因此早期診斷及有效治療CTD-ILD 是目前呼吸科及風(fēng)濕免疫科醫(yī)師亟需解決的難題。目前臨床上ILD 的診斷主要依靠臨床癥狀、肺部聽診及高分辨率CT、肺功能、支氣管肺泡灌洗、肺活檢等檢查手段,但上述檢查手段由于費(fèi)用較高、重復(fù)性差或有創(chuàng)等缺點(diǎn),無(wú)法廣泛應(yīng)用于臨床工作。

血清生物標(biāo)志物是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。IL-27是IL-6/IL-12細(xì)胞因子家族中的一種新型白細(xì)胞介素。有研究[9]證實(shí)全反式維甲酸通過(guò)調(diào)節(jié)Th17與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分化降低IL-17A 的表達(dá),從而減輕肺纖維化。而IL-27在Th17分化調(diào)節(jié)的過(guò)程中發(fā)揮著非常廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能,由此猜想IL-27可能通過(guò)IL-17 介導(dǎo)ILD 的發(fā)生、發(fā)展,其在CTD-ILD 患者中的表達(dá)水平可能不同于正常人。涎液化糖鏈抗原(Krebs von den lungen-6,KL-6)最早由日本人在肺腺癌研究中發(fā)現(xiàn),其本質(zhì)是一種大相對(duì)分子質(zhì)量糖蛋白。KL-6是目前可用于ILD管理的最佳和最可靠的生物標(biāo)志物之一[10]。但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少,其臨床價(jià)值尚無(wú)定論。

故本研究通過(guò)比較血清IL-27、KL-6 在CTD-ILD及CTD 患者中表達(dá)水平的差異,初步探討二者在診斷CTD-ILD 上的價(jià)值,為ILD 的診療提供新方法和思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年4月1日至2018年12月31日于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科和風(fēng)濕免疫科收治的CTD-ILD 和CTD 患者納入本研究,其中CTD-ILD 患者26 例,CTD 患者33例,同時(shí)選擇同期體檢中心健康成人無(wú)ILD、CTD病史及家族史,且均為非吸煙者16名為正常對(duì)照組。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CTD-ILD 尚無(wú)統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn),本研究納入標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下條件： (1)符合ILD 診斷[11]; (2)符合CTD 診斷[12-16]。排除標(biāo)準(zhǔn)： (1)合并急性感染、結(jié)核、支氣管哮喘、COPD、惡性腫瘤;(2)合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全; (3)塵肺、吸入有機(jī)物及其他原因引起的ILD;(4)妊娠及哺乳期婦女;(5)資料不完整及不愿意配合者。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 血清IL-27、KL-6檢測(cè)方法 囑入院患者夜間空腹12 h,于次日清晨采集上肢靜脈全血4 ml,室溫下放置2 h,以3 000 r/min離心10 min,取上層血清保存于-80 ℃冰箱備用。標(biāo)本收齊后解凍,然后嚴(yán)格按照華美生物工程有限公司生產(chǎn)的人IL-27、KL-6試劑盒說(shuō)明書操作步驟,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法測(cè)得IL-27、KL-6水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料正態(tài)性檢驗(yàn)運(yùn)用K-S檢驗(yàn),計(jì)量資料符合正態(tài)分布的采用±s 表示,多組間比較采用單因素方差分析,多組樣本的兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或構(gòu)成比表示,樣本構(gòu)成比用Pearsonχ2檢驗(yàn);繪制受試者工作特征 (receiver operator characteristic,ROC)曲線計(jì)算IL-27、KL-6診斷CTD-ILD 的曲線下面積,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入對(duì)象的臨床特征 CTD-ILD 組和CTD組患者的平均年齡間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但CTD-ILD 組和CTD 組患者的平均年齡均高于正常對(duì)照組(P 值均＜0.05)。3組間性別差異構(gòu)成比、有/無(wú)吸煙史差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F 值分別為6.587、12.500,P 值均＜0.05)。見表1。

表1 3組間一般資料的比較

2.2 血清IL-27和KL-6的表達(dá)差異 結(jié)果顯示,3組研究對(duì)象的血清IL-27濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =4.672,P ＜0.05),進(jìn)一步的組間比較顯示CTD-ILD 組的血清IL-27濃度較CTD 組、正常對(duì)照組明顯升高 (P 值均＜0.05),而CTD 組、正常對(duì)照組間血清IL-27濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組研究對(duì)象的血清KL-6 濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =10.301,P ＜0.05),進(jìn)一步的組間比較顯示CTD-ILD 組、CTD 組的血清KL-6 濃度較正常對(duì)照組明顯升高 (P 值均＜0.05),且CTD-ILD 組的血清KL-6 濃度較CTD 組明顯升高 (P ＜0.05)。見表2。

表2 3組間血清IL-27和KL-6的比較 (±s)

表2 3組間血清IL-27和KL-6的比較 (±s)

注：CTD-ILD為結(jié)締組織病相關(guān)性間質(zhì)性肺疾病;CTD 為結(jié)締組織病;KL-6為涎液化糖鏈抗原;與CTD-ILD 組比較,a P ＜0.05;與正常對(duì)照組比較,b P ＜0.05

組別例數(shù)IL-27 (ng/L)KL-6 (μg/L)CTD-ILD組26 55.34±20.75 4.30±1.23b CTD組33 43.68±18.14a 3.58±1.27ab正常對(duì)照組16 38.79±15.68a 2.43±1.45 F 值4.672 10.301 P 值0.012 0.000

2.3 IL-27、KL-6診斷CTD-ILD 的ROC 曲線 本研究中IL-27、KL-6診斷CTD-ILD 的最佳臨界值為分別為50.86 ng/L、4.26μg/L,曲線下面積分別為0.659 (95%CI：0.517～0.800)、0.664(95%CI：0.525～0.803)。見圖1、2。

2.4 IL-27、KL-6及二者聯(lián)合診斷CTD-ILD 的價(jià)值分析 本研究中CTD-ILD 組和CTD 組患者IL-27、KL-6 分別以50.86 ng/L、4.26 μg/L 為界,二者單獨(dú)及聯(lián)合診斷CTD-ILD 的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表3、4。

圖1 IL-27診斷CTD-ILD的受試者工作特征曲線

圖2 KL-6診斷CTD-ILD的受試者工作特征曲線

表3 IL-27、KL-6及二者聯(lián)合時(shí)CTD-ILD 和CTD 分布情況 (例)

表4 IL-27、KL-6及二者聯(lián)合診斷CTD-ILD 的預(yù)測(cè)價(jià)值 (%)

3 討論

ILD 是CTD 患者死亡的主要原因[8]。因此,提高對(duì)CTD-ILD 的認(rèn)識(shí)水平,將對(duì)制定CTD-ILD患者的治療方案及評(píng)估CTD-ILD 患者的預(yù)后有重要意義。但目前臨床上尚缺乏方便易行、重復(fù)性高、有效的生物標(biāo)志物對(duì)CTD-ILD 的診治進(jìn)行指導(dǎo),很多患者未能得到及時(shí)有效的干預(yù),預(yù)后極差。因此,對(duì)相關(guān)生物標(biāo)志物的探索成為廣大研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

3.1 IL-27和CTD-ILD IL-27是2002年P(guān)flanz等[17]發(fā)現(xiàn)的一種新型IL,是由2條多肽鏈EBI3和p28通過(guò)二硫鍵組成的異二聚體。IL-27主要由活化的單核細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生,在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著促進(jìn)和抑制炎癥的雙重作用。

國(guó)內(nèi)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-27在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化形成中起保護(hù)作用。董昭興等[18]研究發(fā)現(xiàn),在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中IL-27、IL-27R 的m RNA 表達(dá)量均較正常組升高,然后給予外源性的IL-27和IL-27R 進(jìn)行干預(yù),分別于造模后第7、28天處死小鼠,肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示給予了外源性IL-27 小鼠的肺纖維化程度最輕,其次是沒有給予任何干預(yù)的肺纖維化小鼠,程度最重的是給予了IL-27R 的小鼠,從而證實(shí)IL-27對(duì)肺纖維化的形成可能有抑制作用,而且在注射IL-27R 后發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率明顯增加,進(jìn)一步證實(shí)IL-27在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化形成中起保護(hù)作用。另外有相關(guān)臨床研究證實(shí)CTD-ILD 患者的血清IL-27水平呈一個(gè)高表達(dá)狀態(tài)。Yoshizaki等[19]通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)性硬化癥患者血清IL-27水平及分離單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-27的情況,實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞和T 細(xì)胞中IL-27受體的表達(dá),并分析了IL-27對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG、CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥患者血清IL-27水平較健康對(duì)照組升高,并與皮膚和肺纖維化程度及免疫異常程度呈正相關(guān)。Shen 等[20]研究發(fā)現(xiàn)皮肌炎/肌炎患者的IL-27水平明顯高于正常對(duì)照組,且高肌酸激酶和合并間質(zhì)性肺疾病患者的IL-27水平升高程度更明顯。本研究中CTD-ILD 組的血清IL-27水平較CTD 組及正常對(duì)照組升高,與上述研究結(jié)果一致;但CTD 組的IL-27水平并沒有明顯高于對(duì)照正常組,這可能與樣本量較少有關(guān),需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究將CTD-ILD 組和CTD 組患者的IL-27行ROC 曲線分析,結(jié)果顯示其曲線下面積為0.659 (95%CI：0.517 ～0.800),說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)血清IL-27 來(lái)診斷CTDILD 準(zhǔn)確度較低。

3.2 KL-6和CTD-ILD KL-6是日本學(xué)者Kohno等1985年研究肺腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的一種大相對(duì)分子質(zhì)量糖蛋白抗原物質(zhì),類屬于黏液素MUC1家族,其相對(duì)分子質(zhì)量接近200 000[21,10]。KL-6主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、呼吸性支氣管上皮細(xì)胞、支氣管腺漿液細(xì)胞分泌,而在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、支氣管腺體細(xì)胞中無(wú)表達(dá)[10],故又叫肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面抗原。當(dāng)肺泡上皮受損時(shí),Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生,分泌大量的KL-6,并通過(guò)損傷的肺間質(zhì)基底膜滲漏入血,導(dǎo)致血中KL-6濃度升高,故增高的血清KL-6水平可作為肺損傷的敏感性指標(biāo)[22]。有研究[23]指出,KL-6是一種肺成纖維細(xì)胞潛在的促增殖和抗凋亡物質(zhì),影響作用類似于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血小板源性生長(zhǎng)因子,可能是纖維化增殖的啟動(dòng)因子。朱晨等[24]的研究顯示特發(fā)性肺纖維化組血清KL-6高于結(jié)節(jié)病Ⅰ期組和過(guò)敏性肺泡炎組,但與CTDILD 組無(wú)明顯差別。另外不少研究[25-26]已表明KL-6可作為評(píng)估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎等多種結(jié)締組織病肺部受累嚴(yán)重程度的指標(biāo),且其水平與系統(tǒng)性硬化病患者彌散功能、用力呼氣容積呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CTD-ILD 組的血清KL-6水平明顯高于CTD組及正常對(duì)照組,與劉玉夢(mèng)等[27]、馮聰行和許愛國(guó)[28]的研究結(jié)果一致。將CTD-ILD 組和CTD 組患者的KL-6行ROC 曲線分析,結(jié)果顯示其曲線下面積為0.664 (95%CI：0.525 ～0.803),說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)血清KL-6來(lái)診斷CTD-ILD準(zhǔn)確度較低。二者聯(lián)合時(shí)雖然敏感度降低(34.62%),但特異度明顯升高(90.91%)。

CTD 隸屬于風(fēng)濕性疾病,是一組疾病的總稱,這些疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化病、皮肌炎、血管炎等,上述疾病好發(fā)于30～60 歲人群[29]。此次入選的CTD-ILD 組、CTD 組患者多為中老年人,但于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心體檢的多為青中年人群,故本研究中CTD-ILD 組、CTD 組患者的平均年齡較正常對(duì)照組大。本次研究納入的病例數(shù)較少,未能保證組間的性別構(gòu)成及有吸煙史患者比例無(wú)差異,且因經(jīng)費(fèi)限制,未能實(shí)時(shí)檢測(cè)血清IL-27、KL-6 水平,可能影響試驗(yàn)結(jié)果。故本試驗(yàn)結(jié)果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。CTD 是否繼發(fā)ILD,影像學(xué)和臨床特征是最直觀的,也是 “金標(biāo)準(zhǔn)”,但很多CTD-ILD 患者合并呼吸衰竭,無(wú)法很好配合甚至不能完成CT檢查,而臨床特征又受臨床醫(yī)師主觀因素影響,但I(xiàn)L-27、KL-6等血清生物標(biāo)志物標(biāo)本易獲取、可多次重復(fù)檢驗(yàn),當(dāng)然它們可能受到其他疾病或因素干擾,臨床應(yīng)用中還需結(jié)合患者情況。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)IL-27、KL-6在CTDILD 患者血清中的表達(dá)水平顯著高于CTD 患者及正常人,兩者聯(lián)合檢測(cè)在診斷CTD-ILD 上可能有一定價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突