何詩朗 鄧杰 黃雪麟 阮祥才，

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（廣州市第一人民醫(yī)院）麻醉科（廣州510180）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市第一人民醫(yī)院麻醉科（廣州510180）

七氟烷廣泛運(yùn)用在臨床麻醉工作中，臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明全麻藥在兒科手術(shù)中對大腦發(fā)育不利，尤其是在腦發(fā)育的爆發(fā)［1-2］。2016年美國食品藥品管理局（FDA）稱3 歲以下的幼兒多次反復(fù)接觸到麻醉藥會誘發(fā)成年后的學(xué)習(xí)能力方面的風(fēng)險［3-4］。七氟烷在臨床上使用的范圍廣泛，其效價強(qiáng)度可用肺泡最低有效濃度（MAC）來衡。在臨床試驗(yàn)中會使用1.0 MAC、1.3 MAC、1.6 MAC 的七氟烷進(jìn)行全麻手術(shù)的麻醉［5］。在研究七氟烷這種常用麻醉劑在麻醉誘導(dǎo)和麻醉后恢復(fù)期是否會改變小鼠的運(yùn)動中，會使用1 MAC、1.5 MAC、2 MAC 的七氟烷麻醉小鼠［6］；在研究七氟烷導(dǎo)致發(fā)育期小鼠發(fā)生記憶障礙中，使用2.6%七氟烷或1.3%七氟烷處理C57BL/6 乳鼠［7］；有研究表明濃度為1.1%即1 MAC 氟烷抑制了WDR 神經(jīng)元對兩種有害（熱、機(jī)械）和非有害刺激的反應(yīng)［8］；在LU 等［9］處理細(xì)胞時，用4.1%即2 MAC 的七氟烷處理神經(jīng)元或突觸體；3.3%七氟烷處理小膠質(zhì)細(xì)胞30 min 減少脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移，降低促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［10］。對于非小細(xì)胞肺腺癌（A549）和腎細(xì)胞癌（RCC4）細(xì)胞選擇暴露于3.6%七氟烷2 h 檢測對不同腫瘤類型的轉(zhuǎn)移潛能和化學(xué)敏感性［11］。在研究七氟烷突觸后電流的影響時，1 MAC 濃度七氟烷處理時，多能干細(xì)胞的衰變時間顯著延長，在1.5 MAC 當(dāng)量時多能干細(xì)胞的振幅和頻率下降［12］。根據(jù)前人研究，七氟烷在臨床、動物以及細(xì)胞使用的濃度多為1 ～2 MAC 之間且結(jié)合臨床上常用的七氟烷濃度即1.3 MAC，因此擬選擇1.3 MAC 七氟烷濃度作為本研究中的七氟烷濃度是比較合適。

線粒體主要功能是產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），線粒體自噬在很多疾病中都扮演了很重要的角色，有證據(jù)［13］顯示線粒體損傷與大腦缺血/再灌注后的神經(jīng)功能評分下降有關(guān)；有研究顯示線粒體自噬通過抑制海馬區(qū)NLRP3 炎性小體的激活來改善七氟烷誘導(dǎo)的術(shù)后認(rèn)知障礙［14］；THANGARAJ等［15］研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙和線粒體自噬缺陷誘發(fā)HIV-1 TaT 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。若線粒體自噬功能不足，受損的線粒體累積可導(dǎo)致產(chǎn)生過量的ROS，參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程［16-17］。

大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦發(fā)育過程中起重要的作用［18］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞通常保持靜止?fàn)顟B(tài)。七氟烷（2%vol）連續(xù)鎮(zhèn)靜大鼠12 h，檢測細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素-6（IL-6）等全身炎癥標(biāo)志物，用Iba-1 激活小膠質(zhì)細(xì)胞，來評估大腦中的細(xì)胞反應(yīng)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，揮發(fā)性麻醉藥七氟烷并沒有使模型神經(jīng)炎癥的衰減［19］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中涉及小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥，LPS 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，如TNF-α、IL-1β、IL-6［20］。用2%七氟烷在妊娠15 d 處理孕鼠3 h，能誘導(dǎo)IL-6 mRNA 表達(dá)增加，其影響可能會對神經(jīng)元發(fā)育產(chǎn)生長期影響［21］。但也有研究表示暴露于七氟烷麻醉8 h，不能激活小膠質(zhì)細(xì)胞［22］。以往研究發(fā)現(xiàn)氣體麻醉劑七氟烷通過下調(diào)海馬中的PPAR-γ來加重小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，從而加重慢性間歇性缺氧大鼠模型的認(rèn)知功能下降［23］。七氟烷對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，促進(jìn)或抑制其活化，仍存在爭議，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在眾多疾病包括神經(jīng)炎癥及學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙中扮演重要角色，臨床上常用的七氟烷濃度能否使小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及小膠質(zhì)細(xì)胞中的線粒體損傷在小兒手術(shù)中麻醉藥的毒性作用很值得關(guān)注。筆者推測在七氟烷誘導(dǎo)顱內(nèi)炎癥中，特別是七氟烷在幼兒多次接觸的過程中體現(xiàn)出的神經(jīng)毒性作用，很有可能是因?yàn)樾∧z質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的缺陷引發(fā)損傷的線粒體清除不足而使小膠質(zhì)激活，從而引起顱內(nèi)炎癥。本研究旨在觀察在臨床使用濃度范圍內(nèi)七氟烷對、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體狀態(tài)以及自噬情況，揭示如幼兒麻醉出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用等臨床問題的原因，從而為吸入麻醉藥物的合理使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組小鼠來源的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞獲贈于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科實(shí)驗(yàn)室。收集并計數(shù)處于對數(shù)生長期的BV-2 細(xì)胞后以1 × 104個/孔接種至6 孔板培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱使用含10%胎牛血清及1%雙抗的杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)孵育24 h，待細(xì)胞密度到85%左右時，分為不加七氟烷和七氟烷暴露組：按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的給藥濃度和時間，BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞在2.6%～2.8%七氟烷中暴露4 h 為七氟烷組，不暴露在七氟烷中的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞為對照組。

1.2 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的提取按THANGARAJ等［15］的提取方法取出生第0-1 天的C57BL/6j 乳鼠的大腦，放在冰冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中剝除腦膜干凈，把腦組織放到有3 mL DMEM 培養(yǎng)基中剪碎吹打至渾濁液，用40 μm 孔徑的濾網(wǎng)過濾后接種到T75培養(yǎng)皿瓶。48 h后加入25 ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，第10 天即可收半貼壁且透亮的原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞。在第1次收獲小膠質(zhì)細(xì)胞后可每隔2天再收獲1次，最多收獲3次。每次收獲細(xì)胞后直接進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后按實(shí)驗(yàn)需求鋪于孔板上。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 線粒體膜電位檢測七氟烷對小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響，使用JC-1線粒體膜電位測定試劑盒檢測。把BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞置于24 孔板中，密度為每孔1×105個細(xì)胞。計算并取出實(shí)驗(yàn)需要JC-1染色工作，在細(xì)胞經(jīng)過或無七氟烷暴露實(shí)驗(yàn)處理完后吸除培養(yǎng)液，每孔加入JC-1 染色工作液250 μL，并使之充分混勻分布在待測孔中。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。在此孵育期間，計算并配制適量的JC-1 染色緩沖液，并放置于冰上或4 ℃冰箱。37 ℃孵育結(jié)束后，吸除工作液，用JC-1 染色緩沖液避光洗滌3次至干凈。加入DMEM培養(yǎng)液用熒光酶標(biāo)儀檢測線粒體的熒光強(qiáng)度JC-1單體（激發(fā)光為485 nm；發(fā)射光為535 nm）和聚集體（激發(fā)光為550 nm；發(fā)射光為600 nm）。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 CCK-8 法細(xì)胞活力測試收集細(xì)胞計數(shù)后把小膠質(zhì)細(xì)胞置于24 孔板中，密度為每個孔1 ×105個細(xì)胞。分別取100 μL 到96 孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜貼壁，在細(xì)胞經(jīng)過或無七氟烷暴露實(shí)驗(yàn)處理完后吸凈細(xì)胞上清液并用適量PBS洗滌2 次，CCK-8 和無血清DMEM 培養(yǎng)基按1∶10 體積比混合成檢測液并混勻，取100 μL 加入待測孔中，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育1 h；用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度值并記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞接種第2 天后，待細(xì)胞在蓋玻片上伸出偽足時，自培養(yǎng)箱中取出，多聚甲醛固定10 min，放置PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min，滴加BSA，封閉30 min 后滴加按一定比例配好的Iba1 一抗后放于濕盒內(nèi)4 ℃冰箱孵育過夜，次日洗滌3次，稍甩干后滴加與一抗相應(yīng)種屬的555 標(biāo)記二抗覆蓋玻片，避光室溫孵育50 min。DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min 后洗滌，用抗熒光淬滅封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.4 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定用酶聯(lián)免疫吸附測定七氟烷激活小膠質(zhì)細(xì)胞，在酶標(biāo)包被板上準(zhǔn)確加七氟烷組和對照組組細(xì)胞上清液50 μL 后放置于37 ℃中溫育30 min。棄去液體，每孔加滿洗滌液，搖晃洗滌30 s 后棄去，重復(fù)5 次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，后溫育、洗滌。每孔加入顯色液37 ℃避光顯色15 min，加終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀用450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 透射電子顯微鏡將小膠質(zhì)細(xì)胞暴露或不暴露在七氟烷中，處理后用PBS 洗滌細(xì)胞兩次，迅速加電鏡固定液用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞收集到離心管內(nèi)，離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，直至送去透射電鏡顯微鏡拍攝。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism8.0 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位比較CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，七氟烷組與對照組相比較細(xì)胞活力并無明顯下降（圖1），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n= 3，P= 0.891 3）。用JC-1 試劑盒檢測BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位時，七氟烷組檢測發(fā)現(xiàn)紅光比例較對照組少，細(xì)胞的膜電位相對對照組細(xì)胞而言有明顯下降（圖1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.001 0）。

2.2 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌情況比較小膠質(zhì)細(xì)胞激活時分泌炎癥因子如IL-6 增多，酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6 實(shí)驗(yàn)顯示，七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)分泌的IL-6 水平比對照組上升（圖1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.024 3）。

2.3 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定免疫熒光染色對原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定見圖2，DAPI 染細(xì)胞核呈現(xiàn)紫色，Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞呈紅色。

2.4 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位比較CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，加七氟烷組與對照組相比較細(xì)胞活力并無明顯下降（n=3，P=0.185 2，圖3A）。用JC-1 檢測BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位時，把BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞暴露在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）的七氟烷中4 h，結(jié)果顯示在1.3 MAC（2.6%～2.7%）七氟烷的濃度暴露4 h 發(fā)現(xiàn)紅光比例較對照組少，細(xì)胞的膜電位相對對照組細(xì)胞明顯下降（圖3B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n= 3，P=0.040 9）。

2.5 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌情況比較小膠質(zhì)細(xì)胞激活時分泌炎癥因子如IL-6水平上升，酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6 實(shí)驗(yàn)表示，七氟烷組原代小鼠小膠質(zhì)分泌的IL-6 水平較對照組上升（圖4），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.046 3）。

2.6 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞受損線粒體及自噬小體數(shù)量比較在電鏡下觀察對照組及七氟烷組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5A），對照組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，并見較多偽足與突起，細(xì)胞核呈卵圓形，核膜清晰；少量線粒體輕微腫脹，自噬小體數(shù)量較多。七氟烷暴露組細(xì)胞整體呈重度水腫，細(xì)胞膜邊緣局部小面積破損，膜周圍可見少量微絨毛水腫，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，局部輕微凹陷，核膜模糊；線粒體數(shù)量豐富，大部分呈明顯腫脹，部分線粒體膜破損、嵴消失；自噬小體數(shù)量較多。七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞與對照組對比，單個細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體數(shù)量增加（n= 3，P= 0.002 6，圖5B），單個細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n= 3，P=0.022 7，圖5C）。

圖1 JC-1 檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，ELISA 檢測炎癥因子IL-6 分泌水平。Fig.1 JC-1 detects the intracellular mitochondrial membrane potential，and the ELISA detects level of inflammatory factor IL6

圖2 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色鑒定Fig.2 Immunofluorescence staining identification of primary mouse microglial cells

2.7 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞受損線粒體及自噬小體數(shù)量比較在電鏡下觀察對照組及七氟烷組原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞中，單個細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體數(shù)量有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n= 3，P= 0.666 1，圖6A），單個細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量減少差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.031 2，圖6B）。

2.8 加入線粒體自噬誘導(dǎo)劑魚藤酮后原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子分泌情況比較酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6實(shí)驗(yàn)表示，在分別給原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞對照組和七氟烷組加入線粒體自噬誘導(dǎo)劑魚藤酮（1 μmol/L）處理24 h后，魚藤酮-七氟烷組小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6 水平與魚藤酮-對照組小膠質(zhì)細(xì)胞比較（圖7），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.912 6）。

圖3 原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活力及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位Fig.3 Cell viability and mitochondrial membrane potential of primary mouse microglia

3 討論

圖4 ELISA 檢測原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌水平Fig.4 ELISA for detecting the level of inflammatory factor IL-6 in primary mouse microglia

目前臨床上七氟烷適用于各種年齡、各部位的大小手術(shù)，在臨床上使用七氟烷的濃度范圍為1 ～1.5 MAC。既往研究顯示，使用七氟烷多次麻醉可導(dǎo)致新生幼鼠廣泛性神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響中樞可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)，損傷幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［24-25］；大腦中IL-6 等炎癥因子的水平增高，顱內(nèi)炎癥的產(chǎn)生對認(rèn)知功能產(chǎn)生損害［26］，而這可能與小膠質(zhì)細(xì)胞被七氟烷激活，分泌大量如IL-6 等炎癥因子［27］有極大關(guān)系；有研究表明，七氟烷處理小膠質(zhì)細(xì)胞降低炎癥因子的產(chǎn)生，降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［10］。為探討臨床相關(guān)濃度的吸入麻醉藥七氟烷對小鼠來源的BV-2 細(xì)胞系和原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。在本研究中根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)七氟烷在臨床、動物以及細(xì)胞使用的濃度多為1 MAC到2 MAC 之間且結(jié)合臨床上常用的七氟烷濃度即1.3 MAC，采用小膠質(zhì)細(xì)胞在1.3 MAC（2.6%～2.7%）的七氟烷濃度中暴露4 h，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。本研究中，暴露在七氟烷中的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯出現(xiàn)IL-6 等炎癥因子的分泌增多，即七氟烷激活小膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中很重要的一類細(xì)胞，正常情況下對大腦有保護(hù)作用，但過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞則會引起中樞炎癥［28］。在本實(shí)驗(yàn)中，七氟烷激活小膠質(zhì)細(xì)胞可能導(dǎo)致顱內(nèi)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［21，26］。

圖5 電鏡下觀察兩組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.5 Internal structures of two groups of BV-2 microglia were observed with electron microscopy

線粒體是是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生ATP 為細(xì)胞提供能量的場所，膜電位是線粒體合成ATP 的動力，膜電位下降導(dǎo)致細(xì)胞不能合成足夠的ATP而無法完成正常必要的生命活動［29］。本研究結(jié)果顯示，在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）的七氟烷濃度中暴露4 h，原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞或者BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞系的細(xì)胞活力維持不變，線粒體膜電位下降，提示七氟烷損傷小膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體。

圖6 電鏡下觀察兩組原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.6 The internal structure of two groups of primary mouse microglia cells was observed under electron microscope

圖7 ELISA 檢測加入魚藤酮后原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌水平Fig.7 ELISA for detecting the level of inflammatory factor IL-6 in primary mouse microglia treated with rotenone

線粒體自噬是細(xì)胞自噬的一種，也是線粒體質(zhì)量控制的重要機(jī)制，其可選擇性地清除受損或功能不完整的線粒體［30-31］。研究表明，線粒體自噬在線粒體質(zhì)量控制中起著重要的作用［31］，對順鉑相關(guān)神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用［32］。自噬可以分為三大步驟，雙層分隔膜的形成，自噬體的延伸過程，自噬溶酶體的形成與裂解階段。通過電鏡能從形態(tài)學(xué)的角度辨別出自噬小體以及受損的線粒體。在本實(shí)驗(yàn)中通過電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)果，原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞或者BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞系中七氟烷組與對照組相比，七氟烷組小膠質(zhì)細(xì)胞中損傷的線粒體數(shù)量比較多，七氟烷組小膠質(zhì)細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量明顯減少，即在暴露在七氟烷的小膠質(zhì)細(xì)胞對損傷的線粒體清除能力不足，過往的研究發(fā)現(xiàn)受損的線粒體大量增多，除了對細(xì)胞供能產(chǎn)生影響還會讓ROS 積累損傷細(xì)胞使小膠質(zhì)細(xì)胞激活［33-34］，抑制ROS 信號防止小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥產(chǎn)生［34］，提示七氟烷使線粒體自噬過程受到抑制，自噬小體的減少，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活分泌IL-6 增加，促進(jìn)神經(jīng)毒性和神經(jīng)退行性疾?。?5］。

魚藤酮作為線粒體自噬誘導(dǎo)劑，在CHU等［36］的研究中誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中線粒體自噬的增加；在THANGARAJ 等［15］研究中，魚藤酮在小膠質(zhì)細(xì)胞也引起線粒體自噬的增多。本研究根據(jù)THANGARAJ等［15］研究中的魚藤酮劑量以及作用時長作為參考處理小膠質(zhì)細(xì)胞，加入線粒體自噬激動劑魚藤酮后，魚藤酮-七氟烷組與魚藤酮-對照組小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6 水平無明顯差別，即線粒體自噬誘導(dǎo)劑抑制了七氟烷對小膠質(zhì)的激活作用，結(jié)合上文結(jié)果更能反映自噬小體的減少與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。

綜上，由已有的文獻(xiàn)資料及本研究結(jié)果可推斷小膠質(zhì)暴露在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）即臨床使用濃度的七氟烷中，線粒體自噬途徑被抑制，小膠質(zhì)細(xì)胞激活。本研究仍有不足，未能進(jìn)一步探討七氟烷如何使小膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體損傷從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞的即線粒體自噬引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活的具體通路，且本文未能明確七氟烷抑制線粒體自噬過程的哪一具體環(huán)節(jié)，擬下一步在進(jìn)行更深入的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。