崔暢婉, 于 淼, 王 爽, 吳 思, 孫崢嶸

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫(kù), 沈陽(yáng) 110001)

駱駝處于干旱的荒漠地區(qū)，并能在如此惡劣環(huán)境中把鹽堿含量高的粗硬植物轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)含量極高的乳、肉[1]。駱駝奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，而且對(duì)牛乳過(guò)敏的人不會(huì)對(duì)駱駝奶產(chǎn)生類(lèi)似的過(guò)敏癥狀，食用更安全[2]。研究[3]表明，駱駝奶能夠通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化和細(xì)胞因子分泌，糾正失衡的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，在哮喘、糖尿病、肝炎的治療過(guò)程中起到輔助作用。目前，駱駝奶對(duì)炎性腸病患者腸道的黏膜免疫功能是否具有調(diào)節(jié)作用，能否緩解腸道炎癥的疾病進(jìn)程，其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的急性小鼠腸炎模型，通過(guò)灌胃給藥方式給予駱駝奶，檢測(cè)小鼠腸道淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量，探討駱駝奶對(duì)小鼠腸炎的影響，有望為臨床應(yīng)用駱駝奶輔助治療炎性腸病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料和試劑

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠32 只， 6~8 周齡，16~18 g，由華阜康生物科技有限公司提供[SCXK(京)2014-0004]，飼養(yǎng)于本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施[SYXK(遼)2013-0007]。DSS、 Percoll 細(xì)胞分離液均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，抗鼠 CD4-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD44-藻紅蛋白(PE)、γ 干擾素(IFN-γ)-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Percp)、白細(xì)胞介素17α(IL-17α)-藻藍(lán)蛋白(APC)和IL-4-Percp 均購(gòu)自美國(guó)BD 公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生存率和體質(zhì)量影響實(shí)驗(yàn) 20 只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10 只，腸炎誘導(dǎo)前14 d持續(xù)進(jìn)行灌胃操作。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠灌胃駱駝奶0.2 g/次(溶于200 μL 雙蒸水)，對(duì)照組小鼠灌胃雙蒸水 200 μL/次，并于自由飲用DSS 誘導(dǎo)腸炎時(shí)終止灌胃操作。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均在飲用水中注入3% DSS 以誘導(dǎo)急性腸炎模型。開(kāi)始飲用DSS 誘導(dǎo)腸炎記為0 d，記錄至對(duì)照組小鼠全部死亡共7 d。

1.2.2 腸炎炎性指標(biāo)影響實(shí)驗(yàn) 12 只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6 只，腸炎誘導(dǎo)前14 d 持續(xù)進(jìn)行灌胃操作，方法同1.2.1。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均以3% DSS 誘導(dǎo)急性腸炎。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DSS 誘導(dǎo)5 d 起實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，誘導(dǎo)6 d 和7 d 小鼠死亡率過(guò)高。因此在誘導(dǎo)5 d 時(shí)以斷頸法處死小鼠，并取結(jié)腸至肛門(mén)部位腸管進(jìn)行后續(xù)病理學(xué)觀察(HE 染色)、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)和ELISA 實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 病理學(xué)觀察 取0.5 cm 腸管中段浸于體積分?jǐn)?shù)10% 的甲醛溶液中固定，并以梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以及浸蠟制備蠟塊。用切片機(jī)切片，厚度5 μm，45 ℃水浴展片，56 ℃烘片，脫蠟并進(jìn)行HE 染色。病理學(xué)觀察和評(píng)分判斷炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。上皮細(xì)胞評(píng)分：0，正常；1，部分杯狀細(xì)胞損傷；2，大面積杯狀細(xì)胞缺損；3，隱窩損傷；4，大面積隱窩缺失。浸潤(rùn)情況評(píng)分：0，正常；1，浸潤(rùn)隱窩基底；2，浸潤(rùn)至黏膜肌層；3，廣泛浸潤(rùn)黏膜肌層，黏膜增厚，水腫明顯；4，浸潤(rùn)達(dá)黏膜下層。組織學(xué)評(píng)分=上皮細(xì)胞評(píng)分 +浸潤(rùn)情況評(píng)分。

1.2.4 提取小腸固有層淋巴細(xì)胞 斷頸法處死小鼠，75%乙醇溶液消毒，沿腹中線剪開(kāi)小鼠腹部皮膚及黏膜組織，取出肛門(mén)至盲腸段腸管并清洗干凈，剪碎后轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中。向離心管中加入RPMI-1640 培養(yǎng)液35 mL，37 ℃培養(yǎng)20 min；用紗布過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管中離心(3 000 r/min, 2 min)，棄去上清液并以8 mL 45% 密度梯度分離液分離細(xì)胞，將細(xì)胞懸液慢慢加入已放入5 mL 66.6% 硅石膠態(tài)懸浮液(Percoll)的15 mL 離心管中離心(1 200 r/min,15 min)；回收上清液，并用RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析 向小鼠腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA,25 ng/mL)、離子霉素(ionomycin, 1 μg/mL)以及布雷非德菌素A(brefeldin A, 10 μg/mL)，在37 ℃刺激培養(yǎng)5 h 后回收細(xì)胞，加入CD4-FITC 和CD44-PE 進(jìn)行表面染色，之后將細(xì)胞破膜固定，再分別加入IFN-γ-Percp、IL-17-APC 和IL-4-Percp，4 ℃孵育30 min，之后5 500 r/min 離心1 min，棄掉上清液后重懸。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，使用FlowJo 7.6 軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將2×105個(gè)/mL小鼠黏膜固有層淋巴細(xì)胞接種于包被了抗CD3 單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)板(200 μL/孔)，加抗CD28 單克隆抗體并培養(yǎng)48 h，加捕獲抗體過(guò)夜；第2 日封閉后加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品50 μL/孔，室溫避光2 h；加入檢測(cè)抗體后，加辣根過(guò)氧化物酶50 μL/孔，避光20 min；加入底物后20 min 加終止液，上機(jī)檢測(cè)吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 駱駝奶提高腸炎小鼠生存質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降緩慢，平均體質(zhì)量高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。誘導(dǎo)7 d 對(duì)照組小鼠均死亡，而實(shí)驗(yàn)組小鼠仍然有生存(圖2)。

2.2 駱駝奶減輕DSS 誘導(dǎo)的小鼠腸道炎性反應(yīng)

圖1 小鼠經(jīng)DSS 誘導(dǎo)的體質(zhì)量變化Figure 1 Changes of body weight of mice induced by DSS

圖2 經(jīng)DSS 誘導(dǎo)的急性腸炎小鼠生存率Figure 2 Survival rate of acute colitis mice induced by DSS

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠結(jié)直腸均出現(xiàn)上皮結(jié)構(gòu)不完整，隱窩消失及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但實(shí)驗(yàn)組小鼠組織學(xué)評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+IFN-γ+細(xì)胞所占百分比(10.98%±1.47%)高于對(duì)照組小鼠(5.79%±0.92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD4+IL-17+細(xì)胞所占百分比(1.35%±0.07%)低于對(duì)照組小鼠(3.64%±0.09%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道黏膜固有層淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量增高(P<0.05)，TNF-α 和IL-17 水平降低(P<0.05)(表1)。

圖3 DSS 誘導(dǎo)急性腸炎小鼠結(jié)腸HE 染色及病理組織評(píng)分Figure 3 HE staining and pathological tissue score of colon in acute colitis mice induced by DSS

表1 小鼠結(jié)腸黏膜固有層細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17 和TNF-α 含量Table 1 Levels of IFN-γ，IL-17 and TNF-α in the supernatant of lamina propria cells of mouse colon mucosa [ρ/(μg·mL-1), ]

表1 小鼠結(jié)腸黏膜固有層細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17 和TNF-α 含量Table 1 Levels of IFN-γ，IL-17 and TNF-α in the supernatant of lamina propria cells of mouse colon mucosa [ρ/(μg·mL-1), ]

注: 與雙蒸水對(duì)照組比較, *P<0.05。

組別 IFN-γ IL-17 TNF-α對(duì)照組11.64±1.48 17.35±2.02*14.73±1.59 10.86±0.71*實(shí)驗(yàn)組0.82±0.04 0.46±0.03*

3 討論

炎性腸病近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升，發(fā)病機(jī)制包括環(huán)境、遺傳和免疫等多種因素。目前，臨床治療多以水楊酸制劑、激素類(lèi)以及免疫抑制劑治療為主，長(zhǎng)期使用的不良反應(yīng)明顯，因此探究新的治療手段具有重要意義。炎性腸病與Th1/Th2 細(xì)胞比例失衡有關(guān)，Th1 細(xì)胞是Th0 細(xì)胞在IL-12 等細(xì)胞因子作用下分化而成，主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α。Th17 細(xì)胞可分泌的細(xì)胞因子包括IL-17A、IL-17F 和IL-21 等，在多種自身免疫性疾病中起促炎作用[4]。研究[5]顯示，駱駝奶中不飽和脂肪酸比例較牛奶高，機(jī)體不飽和脂肪酸含量與糖尿病發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，糖尿病患者中TNF-α mRNA 呈增高趨勢(shì)，飲用駱駝奶可降低體內(nèi)TNF-α 的含量，進(jìn)而改善糖尿病患者糖脂代謝紊亂癥狀。駱駝奶中具有抗癌活性成分，研究證實(shí)，飲用駱駝奶可抑制多種癌細(xì)胞的增殖，如人乳腺癌、喉癌等[6-7]。駱駝奶中含有的乳鐵蛋白和溶菌酶可以通過(guò)直接抑制病原體入侵感染，增強(qiáng)局部Th1 反應(yīng)，從而增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能[8-9]。駱駝奶及其奶制品中含有雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌。雙歧桿菌和乳酸桿菌能夠抑制Th2 型細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th1 型細(xì)胞增殖，并且有利于絲狀細(xì)菌、梭狀芽胞桿菌和脆弱類(lèi)桿菌生長(zhǎng)，從而增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答[10-11]。

目前，建立炎性腸病動(dòng)物模型的方法主要是通過(guò)外源性化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)，包括惡唑酮、三硝基苯磺酸及DSS[12-13]。本研究以DSS 誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠腸炎模型為研究對(duì)象，模擬人腸道環(huán)境，探究駱駝奶對(duì)腸道黏膜免疫的影響。與雙蒸水對(duì)照組比較，駱駝奶實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降緩慢，生存率提高，組織學(xué)評(píng)分下降，表明駱駝奶對(duì)小鼠急性腸炎有緩解作用。流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色結(jié)果顯示，駱駝奶能促進(jìn)Th1 型細(xì)胞分化，抑制Th17型細(xì)胞分化。Th17 及其分泌的IL-17 是促進(jìn)自身免疫性疾病發(fā)病的重要因素，炎癥性腸病患者血清中Th17 水平較正常人高，并與病程呈正相關(guān)[14-15]。灌胃駱駝奶抑制Th17 細(xì)胞分化，證明駱駝奶通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群增殖和分化，緩解腸炎癥狀。Th1 型細(xì)胞能夠輔助細(xì)胞毒性T 細(xì)胞分化，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。潰瘍性結(jié)腸炎部分患者的腸道黏膜中Th1/Th2 比例失衡。本實(shí)驗(yàn)證明駱駝奶促進(jìn)Th1 型細(xì)胞分化，上調(diào)其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ 水平，有助于緩解疾病進(jìn)展。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠腸黏膜固有層細(xì)胞分泌IL-17 和TNF-α 水平降低，而IFN-γ 水平升高。IFN-γ 具有免疫調(diào)控作用，它可以調(diào)控多個(gè)基因表達(dá)水平，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性[16]，而這些作用在人胃腸道穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中起重要作用。灌胃駱駝奶后，小鼠體內(nèi)IFN-γ 水平增高而IL-17 和TNF-α 水平下降，證明駱駝奶能夠調(diào)節(jié)小鼠腸道細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而緩解腸炎進(jìn)展，為駱駝奶輔助臨床治療炎性腸病提供了新的依據(jù)。綜上所述，本研究證明，駱駝奶能夠調(diào)節(jié)DSS 誘導(dǎo)的急性腸炎小鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞的比例，促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化，抑制Th17 細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ 分泌，抑制IL-17 和TNF-α的分泌。本研究結(jié)果為駱駝奶臨床輔助治療炎性腸病提供了新的可能性。