李 敏, 李光先, 李培寧, 陳梓靈, 劉 穎, 朱素珍, 龐增雄, 劉冬虹, 劉香梅

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002 版)中消毒產(chǎn)品安全性評價(jià)之一的急性眼刺激性試驗(yàn)，是采用活體動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，會對活體動(dòng)物造成不可逆的損傷，不符合社會公眾極大關(guān)注的減少(reduce)、優(yōu)化(refine)、替代(replace)的“3R”原則。在化妝品和化學(xué)品毒理安全性評價(jià)領(lǐng)域，眼刺激性評價(jià)目前應(yīng)用較多的是牛角膜混濁與通透性(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)試驗(yàn)[1-2]。但豬角膜在生理及反應(yīng)結(jié)果方面與人角膜更為接近，另外，東方人的飲食習(xí)慣和宗教信仰等原因?qū)е芦@取牛角膜有一定難度，如果將此方法結(jié)合中國消費(fèi)習(xí)慣進(jìn)行改進(jìn)，用豬眼代替牛眼在消毒產(chǎn)品領(lǐng)域進(jìn)行試驗(yàn)檢測，是可行的[3-5]。

因此，本文應(yīng)用豬角膜，進(jìn)行眼刺激性體外試驗(yàn)條件的探索，建立消毒劑豬角膜眼刺激性檢測方法，期望用于消毒產(chǎn)品眼刺激安全性的評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

豬眼球購自廣東壹號食品有限公司。牛眼球購自廣州市華代生物科技有限公司。新鮮離體眼球浸泡于冰冷的Hank's平衡鹽溶液(HBSS)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

含酚紅的MEM 培養(yǎng)基、無酚紅的MEM 培養(yǎng)基、HBSS 緩沖溶液、胎牛血清和杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS，含鈣鎂離子)均購自美國Gibco 公司；熒光素鈉和咪唑均購自美國Sigma 公司；無水乙醇購自廣州化學(xué)試劑廠；生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)購自江西科倫藥業(yè)有限公司。角膜濁度儀購自德國BASF 公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

參考?xì)W洲經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織(OECD)指南中BCOP 試驗(yàn)，探究無水乙醇和20%咪唑溶液(用0.9%的氯化鈉溶液配制)2 種陽性物的暴露時(shí)間和孵育時(shí)間，使其豬角膜體外刺激評分(in vitro irritancy score，IVIS)處于各自對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間內(nèi)(乙醇39.2~64.1，咪唑68.8~129.9)。

1.2.1 分離和裝配角膜 從新鮮眼球上完整切下角膜，周邊保留 2~3 mm 鞏膜，將其裝配在角膜支架中。前后室均填滿無酚紅的ME M 培養(yǎng)液，于32 ℃培養(yǎng)箱中平衡1 h，更換前后室培養(yǎng)液后，用濁度儀讀取角膜本底濁度(OP)值(即初始OP)。

1.2.2 暴露 分為液體和固體受試物兩類，液體受試物采用無水乙醇作為陽性工具，固體受試物采用20%的咪唑作為陽性工具，移除前室培養(yǎng)液后加入750 μL 無水乙醇或20%咪唑，于培養(yǎng)箱中分別暴露不同時(shí)間(無水乙醇暴露時(shí)間為6 min、8 min、10 min、12 min 和14 min，咪唑暴露時(shí)間為2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h)，充分清洗后，將前室重新填滿無酚紅的MEM 培養(yǎng)液。無水乙醇組培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h 后讀取OP 值(即末次OP)，咪唑組直接讀取OP 值(即為末次OP)。

1.2.3 OP 和滲透性檢測 去除前室培養(yǎng)液，加入1 mL 0.4%液體受試物或0.5%固體受試物(由含Ca2+和Mg2+的DPBS 配制的熒光素鈉溶液)，分別孵育50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min、120 min 和130 min 后收集后室全部液體，混勻后取360 μL 在490 nm 波長下讀取吸光度(A)值 。以生理鹽水為陰性對照。當(dāng)校正OP 變化值接近乙醇或咪唑的IVIS 范圍時(shí)，取當(dāng)前暴露時(shí)間段進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整優(yōu)化(包括孵育時(shí)間)，使各自的IVIS 處于標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

1.2.4 試驗(yàn)條件驗(yàn)證 方法建立后，選取液態(tài)消毒劑和固態(tài)消毒劑分別作用于豬角膜和牛角膜，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)算OP 變化值(△OP=初始OP-末次OP)、校正OP 變化值(OPCor.= △OP陽性-△OP陰性對照)和校正A 值(ACor= A陽性-A陰性對照)，并計(jì)算IVIS(IVIS=OPCor+ 15×ACor)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)平行，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以表示，不同組間比較采用SPSS 20軟件進(jìn)行ANOVA 方差分析，P ＜0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件探索

2.1.1 暴露時(shí)間探索 隨著乙醇暴露時(shí)間增加，A值和IVIS 值相應(yīng)增加(表1)。乙醇暴露10~14 min，IVIS 均在體外評分范圍。因此，選擇暴露時(shí)間10 min 進(jìn)行下一步孵育時(shí)間的探索。

表1 乙醇暴露不同時(shí)間的IVIS探索 Table 1 IVIS exploration with different exposure times of ethanol (, n=3)

表1 乙醇暴露不同時(shí)間的IVIS探索 Table 1 IVIS exploration with different exposure times of ethanol (, n=3)

注: OPcor為角膜本底濁度校正值, A為490 nm波長下吸光度, IVIS 為體外刺激評分。

作用時(shí)間/min OPCor A IVIS 6 8 10 12 14 29.67±0.89 33.89±0.45 36.58±0.44 43.56±0.87 54.36±0.31 64.93±0.64 0.11±0.03 0.14±0.04 0.18±0.04 0.21±0.06 0.28±0.05 0.53±0.07 31.32±2.03 35.99±1.78 39.28±1.23 46.71±1.43 58.56±2.35 72.88±2.78 16

隨著咪唑暴露時(shí)間增加，A 值和IVIS 值相應(yīng)增加。暴露3~5 h，IVIS 均在咪唑的體外評分范圍，詳見表2。因此，選擇暴露時(shí)間3 h 進(jìn)行下一步孵育時(shí)間的探索。

表2 咪唑暴露不同時(shí)間的IVIS探索 Table 2 IVIS exploration with different exposure times of imidazole (,n=3)

表2 咪唑暴露不同時(shí)間的IVIS探索 Table 2 IVIS exploration with different exposure times of imidazole (,n=3)

注: OPcor為角膜本底濁度校正值, A為490 nm波長下的吸光度, IVIS 為體外刺激評分。

作用時(shí)間/h OPCor A IVIS 2 3 4 5 6 53.23±2.32 75.45±2.56 93.87±1.26 112.21±2.37 131.36±3.50 0.25±0.10 0.30±0.12 0.31±0.08 0.35±0.09 0.38±0.07 56.98±2.30 79.95±2.54 98.52±3.69 117.46±4.25 137.06±3.21

2.1.2 孵育時(shí)間探索 在乙醇暴露10 min 和咪唑暴露3 h 后，進(jìn)行豬角膜孵育。由表3 可看出，乙醇組在孵育80 min 后A 值不再增加，咪唑組孵育70 min 后A 值不再增加。因此選擇以上兩個(gè)時(shí)間進(jìn)行下一步探索驗(yàn)證。

表3 乙醇、咪唑暴露后不同孵育時(shí)間的A 值Table 3 Absorbance values at different incubation times after exposure to ethanol and imidazole (, n=3)

表3 乙醇、咪唑暴露后不同孵育時(shí)間的A 值Table 3 Absorbance values at different incubation times after exposure to ethanol and imidazole (, n=3)

作用時(shí)間/min 乙醇組 咪唑組 50 60 70 80 90 100 110 120 130 0.15±0.02 0.18±0.04 0.18±0.05 0.19±0.03 0.19±0.01 0.19±0.04 0.19±0.03 0.19±0.03 0.19±0.01 0.30±0.10 0.31±0.08 0.32±0.09 0.32±0.07 0.32±0.08 0.32±0.05 0.32±0.06 0.32±0.05 0.32±0.08

表4 不同形態(tài)消毒劑作用下豬、牛角膜的IVISTable 4 IVIS of pig and bovine cornea under the action with different forms of disinfectant (, n=3)

表4 不同形態(tài)消毒劑作用下豬、牛角膜的IVISTable 4 IVIS of pig and bovine cornea under the action with different forms of disinfectant (, n=3)

組 別 豬角膜 牛角膜無水乙醇液態(tài)消毒劑生理鹽水(陰性對照)咪唑固態(tài)消毒劑生理鹽水(陰性對照)40.15±3.68 2.69±1.02 2.54±0.76 72.59±2.13 10.25±1.56 2.85±0.31 42.80±2.56 2.57±1.19 2.28±0.58 74.05±3.92 9.31±2.87 2.68±0.49

2.2 試驗(yàn)條件驗(yàn)證

液態(tài)消毒劑暴露10 min、孵育80 min，固態(tài)消毒劑暴露3 h、孵育70 min 后，豬角膜IVIS與牛角膜IVIS 相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

3 討論

從1990 年代開始，眼刺激的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法陸續(xù)進(jìn)入驗(yàn)證程序。2009 年，BCOP 試驗(yàn)被OECD 認(rèn)可，列入化學(xué)品毒性測試指南的眼刺激替代方法(TG437)。至今，有效的和法規(guī)認(rèn)可的眼刺激替代方法共有8 項(xiàng)[1]。2015 年，OECD 起草了用于眼刺激性測試和評估的整合方法，并于2017 年7 月20 日正式發(fā)布指南263[6]。該方法詳細(xì)說明了BCOP 等替代方法在眼刺激性評估中的應(yīng)用，該標(biāo)準(zhǔn)方法具有快速、簡便和不受樣品限制等優(yōu)點(diǎn)，可單獨(dú)或組合用于化學(xué)品、個(gè)人護(hù)理品配方和成品、抗菌產(chǎn)品、家居護(hù)理品等的單次眼刺激性預(yù)測[7-10]。

本研究創(chuàng)新性地采用離體豬角膜進(jìn)行消毒產(chǎn)品的眼刺激性毒性測試探索，分別應(yīng)用BCOP 試驗(yàn)的兩種陽性物作為探索工具，探索最佳試驗(yàn)條件。在暴露時(shí)間探索中可看出暴露時(shí)間越長，OP 值越大，角膜從“透亮”越發(fā)“發(fā)白”，提示角膜上皮基質(zhì)可能發(fā)生蛋白變性，導(dǎo)致透光性減弱，陽性效果顯著。孵育時(shí)間90 min 的前提下，從表1和表2 可篩選出較合適的乙醇和咪唑暴露時(shí)間分別為10~14 min 和3~5 h，這時(shí)的IVIS 與質(zhì)控體外評分范圍接近。本著效率原則，選取10 min 和3 h進(jìn)行下一步滲透性孵育時(shí)間的探索。對于滲透性指標(biāo)，A 值用于評價(jià)角膜上皮層的完整性[11]。由表3 可以看出短時(shí)間內(nèi)，A 值隨時(shí)間遞增而增加，乙醇組80 min、咪唑組70 min 后A 值不再增加，提示角膜上皮層可能已經(jīng)破壞，滲透達(dá)到峰值?；谪i角膜面積小于牛角膜面積，故暴露時(shí)間小于10 min 和4 h 使角膜損壞是可能的。

本研究將2 種消毒劑盲樣按照以上試驗(yàn)條件同時(shí)作用于豬角膜和牛角膜，得到對應(yīng)的IVIS，由表4 可以看出同一物質(zhì)同時(shí)作用豬角膜和牛角膜的IVIS 無顯著差異，因此該試驗(yàn)條件下能應(yīng)用于消毒產(chǎn)品的體外替代檢測。

本研究建立的消毒產(chǎn)品眼刺激性試驗(yàn)體外檢測方法，是BCOP 測試方法的進(jìn)一步創(chuàng)新，對消毒產(chǎn)品體外眼刺激毒理安全性評價(jià)可能具有重要意義。