張雅雯, 朱光旭, 李雅喆, 李 昊, 王紹曄, 張皓云, 王鳳斌

(1. 濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學院, 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院, 濰坊 261053;3. 華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院/動物醫(yī)學院, 武漢430070;4. 濰坊醫(yī)學院生物科學與技術學院, 濰坊261053)

大段骨缺損是臨床骨科的一大難題，研發(fā)理想的骨科材料對于骨缺損的修復有著廣闊的發(fā)展前景。大鼠顱骨缺損模型具有可重復性強、適宜于多種不同類型骨科材料的應用評估等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于骨組織工程實驗研究[1-2]。臨界骨缺損(critical size defects, CSD)是指在特定骨和動物中，活體動物不會自發(fā)愈合的最小骨缺損[3]。雙側(cè)直徑5 mm 的骨缺損是最典型的大鼠顱骨CSD。與體內(nèi)其他骨相比，顱骨中血液供應及骨再生能力均較差，因此，顱骨CSD 動物模型是評價骨科材料體內(nèi)骨修復性能的理想模型[4]，但在構(gòu)建模型過程中出血、硬腦膜和腦組織損傷等并發(fā)癥會影響骨科植入材料在體內(nèi)的骨修復過程，甚至導致動物死亡率增加。本研究改良了動物模型制備方法，以期建立損傷小、成功率高、能有效評價骨科材料性能的大鼠顱骨缺損模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級12 周齡雄性SD 大鼠40 只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)2019-0003]，體質(zhì)量300~350 g，隨機分為對照組16 只和實驗組24 只。大鼠飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學院動物實驗中心[SYXK(魯)2019-0016]。本課題所有實驗步驟均經(jīng)濰坊醫(yī)學院實驗動物倫理委員會核準(準字號:2019SDL033)。

1.2 主要儀器與試劑

小動物骨鉆(南京卡爾文生物科技有限公司，KW-LGZ)，配套空心環(huán)鉆頭(外徑5 mm，內(nèi)徑4 mm)，實心磨鉆頭(直徑1 mm)；水合氯醛(北京西濃科技有限公司)；氧化鋁生物陶瓷(直徑5 mm，厚度2 mm)，由北京中材高新材料股份有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照組大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建 將對照組16 只大鼠用質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛(3.0~3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術臺上。對照組大鼠常規(guī)手術[5]，只用空心環(huán)鉆頭垂直于顱骨表面用力，在矢狀縫左右兩側(cè)的頂骨各鉆取直徑5 mm 的圓形全層骨缺損。從骨缺損處分別植入氧化鋁生物陶瓷，逐層縫合。術后動物側(cè)臥位，注意保溫，連續(xù)3 d 每日每只肌肉注射青霉素(20 萬單位)以防止感染。

1.3.2 實驗組大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建

1.3.2.1 暴露顱骨 將實驗組24 只大鼠從鼻骨開始，沿頭頂部正中線縱行皮膚切口1.5~2.0 cm，用手術刀柄輕輕分離皮下組織。然后沿顱骨矢狀縫整齊切開骨膜，手術刀柄仔細剝離骨膜下組織，充分暴露雙側(cè)頂骨、枕骨和部分額骨。

1.3.2.2 顱骨鉆孔及材料植入 手術中用無菌生理鹽水滴注降溫(1~2 滴/s)，于大鼠顱骨頂中線兩側(cè)各鉆取一個直徑為5 mm 的圓形全層骨缺損。開始先用空心環(huán)鉆頭低速(1 400~1 500 r/min)垂直方向鉆取顱骨，避免轉(zhuǎn)速過快不易控制而導致鉆頭傷及硬腦膜。開始時可稍微附加外力，以增加顱骨鉆取速度并縮短手術時間。接近顱骨鉆穿時需動作輕柔，鉆頭由垂直位分別向前、后、左、右四個方向傾斜20°~30°，不再附加外力，單純憑借電鉆的自然重力使大部分顱骨間斷鉆穿(圖1A)，保留少部分顱骨的連接。然后用眼科鑷子測試顱骨有松動后，沿著周邊圓形缺損將顱骨去除(圖1B)。再用實心磨鉆頭仔細打磨骨缺損周邊少量殘留骨組織(圖1C)。植入氧化鋁生物陶瓷(圖1D)，然后逐層縫合。

圖1 改良大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建手術過程Figure 1 The construction process of modified rat skull defect model

1.3.3 觀測指標 觀測和比較對照組和實驗組手術中顱骨鉆孔 (每只大鼠鉆2 個孔) 時間，以及出血(≥0.1 mL)、硬腦膜損傷(腦組織暴露)和腦組織損傷(鉆頭觸及腦組織)等并發(fā)癥發(fā)生情況；手術后1 周觀察大鼠切口有無紅腫和滲出；手術后8 周，麻醉動物，沿著原來手術切口暴露顱骨缺損部位，大體觀察氧化鋁生物陶瓷有無松動或者移位。在構(gòu)建模型手術中無硬腦膜和腦組織損傷，術后材料無移位，即確定造模成功。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用表示，組間差異比較采用t 檢驗和χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 顱骨鉆孔時間

實驗組每只大鼠顱骨鉆2個孔的時間為 (6.00 ±2.47)min，與對照組的(9.25±3.49)min 比較，時間明顯縮短(P<0.01)。

2.2 手術中和手術后觀察指標

實驗組手術中的出血、硬腦膜損傷和腦組織損傷等并發(fā)癥發(fā)生率較對照組明顯減少(P<0.05)。實驗組手術后7 d，大鼠傷口愈合情況良好，無皮下滲出和腫脹；手術后8 周骨科材料固定位置良好，無移位和松動，與周圍骨組織連接緊密。實驗組造模成功率為95%(23/24)，明顯高于對照組的62%(10/16)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

3 討論

由創(chuàng)傷及疾病所導致的骨缺損是目前臨床較難解決的問題之一，而骨缺損修復已成為人們研究的一個熱點。組織工程技術為治療骨缺損提供了新的研究方向和思路[6-7]，不同的骨修復材料首先需要進行動物實驗體內(nèi)評估與檢測才能應用于臨床。大鼠具有容易飼養(yǎng)、生長較快、對傳染病的抵抗力較強等優(yōu)點，通常選擇成年雄性大鼠進行實驗，以避免大鼠本身的激素水平和年齡對骨缺損組織修復能力的影響。Bosch 等[8]認為，大鼠顱骨缺損直徑為5 mm 時，除了在缺損邊緣處有少量的骨形成之外，直到術后12 個月都不能完成骨性修復。在顱骨矢狀縫的左右兩側(cè)建立CSD 可以避免損傷矢狀竇，此大鼠顱骨缺損模型應用比較廣泛。然而在傳統(tǒng)的顱骨鉆取過程中很容易出現(xiàn)硬腦膜、腦組織損傷及出血等并發(fā)癥，影響骨修復過程。

表1 兩組大鼠手術中、手術后出現(xiàn)并發(fā)癥及造模成功情況Table 1 Comparison of complications during and after surgery and successful modeling between the two groups of rats (例)

生物陶瓷材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分子中的鍵合力較強，而且都具有較高的強度、耐磨性及化學穩(wěn)定性等特點，因此被廣泛應用于組織工程和生物醫(yī)學研究[9]。氧化鋁是目前臨床常用的生物陶瓷材料[10]，具有化學性能穩(wěn)定、耐磨損、耐腐蝕和良好的生物學相容性等優(yōu)點，已廣泛應用于人工關節(jié)、整形外科和牙科等醫(yī)學領域[11]。本實驗將氧化鋁生物陶瓷材料植入骨缺損處，評估傳統(tǒng)與改良大鼠顱骨缺損模型制備方法對骨修復作用的影響。

本實驗模型的改良關鍵在于：①手術中采用2 種鉆頭，空心環(huán)鉆頭用于鉆取顱骨，實心磨鉆頭用于打磨骨缺損周邊少量殘留骨組織，改變了一種鉆頭直接鉆穿顱骨后容易損傷硬腦膜和腦組織的情況，縮短了手術時間，同時保證顱骨缺損尺寸與植入材料相匹配。②用手術刀片整齊切開骨膜，一方面利于術后縫合，縫合好的骨膜和顱骨下的完整硬腦膜能較好固定植入的生物材料，另一方面能充分發(fā)揮骨膜和硬腦膜在骨組織修復過程中的骨誘導和促進新骨形成的作用。③手術中，當顱骨接近鉆穿時，不再施加外力，而且將空心鉆頭傾斜20°~30°，首先使骨缺損邊緣大部分顱骨間斷被鉆穿，但還保留少部分顱骨的連接，避免顱骨組織同時完全被鉆穿后鉆頭直接觸及顱骨下組織而導致?lián)p傷和出血。④避免損傷后血液中間充質(zhì)干細胞、成骨細胞因子等進入骨缺損處干擾實驗結(jié)果，而且同一大鼠顱頂骨兩側(cè)分別制作的5 mm CSD 可用于自身對照研究，減少其他干擾因素對于骨缺損修復的影響。

骨缺損動物模型的建立對于骨組織工程研究有重要意義。改良的大鼠顱骨缺損模型建立時較好保護了骨膜、硬腦膜和腦組織，尤其是對經(jīng)驗不足的初學者，明顯降低手術中并發(fā)癥的發(fā)生，大大提高造模成功率，該模型具有高度的可重復性，更安全有效，可應用于不同類型骨修復材料的評估與檢測。