趙征　李迎春　劉飛

摘要 目的 探討miRNA-374對心肌缺血再灌注損傷是否存在保護作用。方法 取SD新生大鼠，分離心肌組織細胞培養(yǎng)，隨機分為空白組（Blank）、陰性對照組（NC）（轉染miRNA-374陰性對照序列），miRNA-374模擬組（轉染miRNA-374模擬基因），miRNA-374抑制劑組（轉染 miRNA-374抑制劑）、siRNA-DTNA組（轉染siRNA-DTNA）和miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組（轉染miRNA-374抑制劑和siRNA-DTNA）。分別觀察各組心肌細胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）的水平，并檢測各組心肌細胞增殖及凋亡情況。結果 ①過表達miRNA-374和DTNA會使AKT、Hes1、bcl2表達上升，使Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達下降;②上調miRNA-374、下調DTNA能保護心肌細胞、促進心肌細胞增殖、改變心肌細胞的細胞周期、抑制心肌細胞凋亡。結論 miRNA-374通過介導DTNA下調，并阻斷Notch1通路，從而保護心肌細胞免受缺血再灌注的損傷。

關鍵詞 miRNA-374;DTNA;心肌缺血再灌注損傷

中圖分類號? R743.3? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2020）10-033-06

PROTECTIVE EFFECT OF MIRNA-374 ON ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY Zhao Zheng，Li Yingchun，Liu Fei.Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061001，China

Abstract? Objective To explore the protective effect of miRNA-374 on myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods SD neonatal rats were divided into blank group， negative control group （NC） （transfection of miRNA-374 negative control sequence），miRNA-374 simulation group （transfection of miRNA-374 analog gene） and miRNA-374 inhibitor group （transfection of miRNA-374 inhibitor）.siRNA-DNA group （transfected siRNA-DINA） and miRNA-374 inhibitor siRNA-DNA group （transfection of miRNA-374 inhibitors and siRNA-DTNA）.The levels of superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA） and lactate dehydrogenase （LDH） in cardiac myocytes were observed.Results ①Overexpression of miRNA-374 and DTNA increased the expression of AKT，Hes1，bcl2， and decreased the expression of Notch1，DTNA，Bax，HIF-1α.②Upregulation of miRNA-374，down-regulation of DTNA can protect cardiomyocytes，promote cardiomyocyte appreciation，change the cell cycle of cardiomyocytes，and inhibit cardiomyocyte apoptosis.Conclusion miRNA-374 protects the cardiomyocytes from ischemia-reperfusion injury by mediating the down-regulation of DINA and blocking the Notch1 pathway.

Key words? miRNA-374;DTNA;Myocardial ischemia-reperfusion injury

心肌缺血再灌注損傷是指在心肌缺血一段時間后恢復組織血流灌注從而造成的組織損傷，通常會引起細胞死亡，導致梗死面積的擴大，誘發(fā)心衰，并增加患者的死亡率[1-2]。合并ST段抬高的急性心肌梗死患者更容易經歷再灌注損傷[3]，對于再灌注損傷最有效的治療是及時的冠脈溶栓治療以及經皮冠狀動脈介入治療。目前對于心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的原因尚不完全明了，可能與氧自由基、炎癥反應、細胞凋亡、鈣超載等原因有關[4]。微小RNA（miRNA）屬于一個具有大約21個核苷酸短長度的非編碼RNA家族。有序列研究證明包括心臟纖維化、心肌肥大、心肌梗死、心力衰竭以及血管生成在內的心血管疾病發(fā)病機制均涉及 miRNA。本研究亦通過miRNA-374感染心肌細胞，并通過一系列實驗來探究miRNA-374對心肌細胞缺血再灌注損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉染

從廣東省醫(yī)學實驗動物中心購買了SPF雄性大鼠（這項研究是嚴格按照美國國立衛(wèi)生研究院“保護和使用實驗動物指南”中的建議進行的。該協(xié)議得到了滄州市中心醫(yī)院動物保護與利用機構委員會批準）。處死后用眼科剪將大鼠心肌組織切成1mm3大小的組織塊，然后用D-Hanks液沖洗。去除上清液后加入含有0.15%膠原酶的低糖DMEM。隨后，將組織塊放到無菌離心管，在37℃的恒溫電磁攪拌器上放置30分鐘，99克，并轉速離心5分鐘，收集沉淀物，然后懸浮在含20%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM中，99克，再次離心5分鐘。去除上清液，用D-Hanks液沖洗后，用0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA） 在37℃下作用7～9分鐘。加入含20%FBS的培養(yǎng)基，209克，離心5分鐘后收集沉淀，再懸浮于含20%FBS的DMEM后接種于新的培養(yǎng)皿中。將細胞懸液放置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃下連續(xù)培養(yǎng)，每隔2、3天換一次培養(yǎng)基。

1.2 實驗分組

取指數生長的細胞，進行分組實驗。分為空白組（Blank）、陰性對照組（NC）（轉染miRNA-374陰性對照序列），miRNA-374模擬組（轉染miRNA-374模擬基因），miRNA-374抑制劑組（轉染 miRNA-374抑制劑）、siRNA-DTNA組（轉染siRNA-DTNA）和miR-374抑制劑siRNA-DTNA組（轉染miRNA-374抑制劑和siRNA-DTNA）。

1.3 試驗方法

將對數生長心肌細胞種植在六孔板中。當細胞密度達到30%～50%時，按脂質2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）的說明轉染。分別取各實驗組細100 pmol，用250μL無血清Opti-mem培養(yǎng)基（Gibco，Grand Island，NY）稀釋后在室溫下孵育5分鐘。同時將250μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基與5μL Lipofectamine2000混合，室溫孵育5分鐘。將兩種制劑混合，室溫孵育20分鐘后將細胞種植到培養(yǎng)孔中，37℃下孵育6～8小時。最后，換成全培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48小時后可收獲細胞。

1.4 大鼠心肌細胞超氧化物歧化酶、丙二醛和乳酸脫氫酶的檢測

收集轉染大鼠心肌細胞，置于冷凍離心機3221克離心15分鐘，用Eppendorf管收集部分上清液保存于?20℃環(huán)境。根據檢測試劑盒（中國上海Mlbio有限公司）的使用方法分別測定上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）的含量。SOD濃度用黃嘌呤氧化酶法測定，而MDA的濃度則用其與硫代巴比妥鈉反應的紅色產物的OD值間接測定。

1.5 大鼠心肌細胞增值能力的檢測

轉染后細胞匯合率達80%時，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞，0.25%胰蛋白酶處理后產生單個細胞懸液。然后對細胞進行計數并以3×103- 6×103/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24、48和72小時后，將培養(yǎng)基換成10%的噻唑藍（MTT）溶液培養(yǎng)4小時。然后去掉上清液，加入100μL二甲基亞砜，在搖床上震蕩孵育10分鐘。測量每個孔在490 nm波長處的OD值。每個實驗都是重復3次，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞活力曲線。

1.6 流式實驗測細胞周期和凋亡

將細胞培養(yǎng)48小時后用0.25%胰蛋白酶消化并收集，將細胞密度調節(jié)為1×106個/mL。隨后，取1毫升的細胞懸液以453克離心10分鐘收集細胞，然后重新懸浮在2mLPBS中離心，用70%預冷乙醇溶液在4℃下固定。第二天對固定細胞進行清洗。 用PBS清洗2次，過濾100μL細胞懸浮液（含有至少106m/L細胞）。隨后，將單細胞懸浮液與1mL碘化丙啶（PI）（50mg/mL）混合后在黑暗中孵育30分鐘。用流式細胞儀在488 nm處測定細胞周期。

用V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。收集細胞的方法與細胞周期檢測方法相同。然后添加了V-FITC（10μL）和PI（5μL）。 將細胞在黑暗中孵育15分鐘后加入300μL結合緩沖液后，用流式細胞儀在488 nm處檢測到細胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以“均數±標準差”表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析方法，兩兩比較采用方差分析方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組miRNA-374、相關基因的mRNA及蛋白水平比較

轉染結束后通過RT-PCR和Western來分析比較各組miRNA374的表達情況，以及AKT、Hes1、bcl、Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α的細胞因子的基因和蛋白表達水平，見圖1。兩兩比較結果顯示，各指標空白組和陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;miRNA374模擬組的AKT、Hes1、bcl2、表達水平高于空白組和陰性對照組（P<0.05），Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達水平低于空白組和陰性對照組（P<0.05）;與陰性對照組比較，miRNA-374的表達水平在miRNA模擬組和siRNA-DTNA組均明顯升高，兩組中AKT、Hes1、bcl2表達均上升，Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達均下降，但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。miRNA-374抑制劑組中的AKT、Hes1、bcl2表達下降，而Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達上升（P<0.05）。

2.2 各組心肌細胞SOD、MDA、LDH含量比較

提取并比較各組心肌組織中SOD、MDA、LDH的表達水平。兩兩比較結果顯示，與空白組和陰性對照組相比，過表達miRNA374會導致SOD水平明顯上升和MDA、LDH明顯下降;下調表達DTNA會導致SOD水平明顯下降和MDA、LDH明顯上升;SOD、MDA、LDH的水平在miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組無明顯改變;這證明上調miRNA374、下調DTNA能保護心肌細胞，見表1。

2.3 各組細胞增殖能力的比較

經過處理后的各組細胞被接種于96孔板，于相應時間后收集并計數。通過MTT實驗與0、24、48、72小時觀察細胞增殖情況。各組細胞的增殖情況在24小時無明顯差異，在48、72小時開始出現差異（P<0.05）。空白組和陰性對照組之間各個時間段細胞殖情況差異均無統(tǒng)計學意義，siRNA374模擬組和siRNA-DTNA組心肌細胞增殖能力增強;而siRNA374抑制劑組細胞增殖能力下降;miR-374抑制劑+siRNA-DTNA組細胞的增殖能力無明顯變化（P>0.05）。這證實過表達miR-374、抑制DTNA能增強心肌細胞增殖能力，見圖2。

2.4 各組細胞周期分布

通過PI染色來觀察細胞周期分布。miR-374抑制劑組與空白組和陰性對照組之間細胞周期分布差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。

2.5 各組細胞凋亡比較

各組心肌細胞的凋亡率檢測結果，見圖4?？瞻捉M、陰性對照組、miRNA-374組、siRNA-DTNA組、miRNA-374抑制劑組、和miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組的凋亡率分別為：（34.18±2.78）%，（31.18±2.44）%，（20.36±

1.74）%，（18.37±2.21）%，（45.59±3.43）%，（32.19±2.20）%。凋亡率在空白組和NC組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與空白組比較，miRNA-374組和siRNA-DTNA組的凋亡率明顯下降（P<0.05）;miRNA-374抑制劑組的凋亡率比空白組明顯增加（P<0.05）;miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組的凋亡率與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。表明上調miRNA374、下調DTNA能抑制心肌細胞凋亡。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是一個動態(tài)的過程，缺血器官損傷和炎癥介導再灌注損傷的分期不同，但相互關聯(lián)[5]。心肌缺血再灌注損傷對心臟術后早期心功能的損害存在一定影響 [6]. 此外，心肌缺血再灌注損傷與炎癥、內皮功能障礙、凋亡和壞死密切相關[7-8]?，F如今對于惡性心血管疾病的處理措施不僅僅是恢復心臟的血供，而且要同時預防由于缺血-再灌注帶來的心肌損傷。

隨著對 Micro RNA越來越多的研究，其在心臟保護方面的作用逐漸被發(fā)現。先前的研究表明，miRNA-21通過Akt和Bcl-2/Bax途徑對心臟缺血再灌注損傷起到保護作用[9] .本研究中我們通過miRNA-374感染心肌細胞，并通過一系列實驗來探究miRNA-374對心肌細胞缺血再灌注損傷的作用。NOTCH 1是Notch家族的成員之一，在許多癌癥中調節(jié)細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲[10]。先前的研究表明[11-12]，NOTCH信號可以被上調的miRNA-34a所抑制。另有研究發(fā)現褪黑素[13]可以通過降低Bax的表達從而抑制心肌細胞凋亡。Cao等[14]證實了在H9C2細胞系中上調野生型DTNA可以抑制心房利鈉因子（ANF）和腦利鈉肽（BNP）的轉錄，表明DTNA通過作用于 ANF和BNP進而保護心肌細胞的功能。DTNA是miRNA-374的目標蛋白，過表達miRNA-374會使DTNA表達下調，同時阻斷Notch1通路。培養(yǎng)正常心肌細胞，過表達miRNA-374，心肌細胞活性增強，凋亡和壞死減少，處于細胞周期S階段的心肌細胞數量增加。本實驗證實，miRNA-374會介導DTNA下調，并阻斷Notch1通路，上調miR-374和下調DTNA可增加Akt、Hes1和bcl-2的表達，而減少Notch 1、bax和HIF-1α的表達，從而保護心肌細胞免受缺血再灌注的損傷。此結論與之前所發(fā)布的報告結論一致[15]。

綜上所述，我們的研究表明，miRNA-374下調DTNA，阻斷Notch 1軸，進一步保護大鼠心肌缺血再灌注損傷。本研究為心肌缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。然而，還需要進一步研究miRNA-374影響心肌I/R損傷的具體機制。

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[2020-4-27收稿]

作者單位：061001 河北省滄州市中心醫(yī)院