郝占偉 吳星星

連云港市第二人民醫(yī)院兒外科，連云港，222000，中國(guó)

機(jī)體器官及組織缺血后如果再次得到血液灌注，不僅無(wú)法導(dǎo)致器官及組織功能恢復(fù)，反而加重結(jié)構(gòu)損傷及功能障礙，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注［1］。腸缺血再灌注損傷（intestinal ischemia-reperfusion，IIR）是由于小腸移植、腸梗阻、嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克等多種原因引起的一種病理生理現(xiàn)象，既會(huì)導(dǎo)致腸損傷，又會(huì)致使遠(yuǎn)隔臟器損傷［2］。肝臟在組織學(xué)、解剖學(xué)上的特征導(dǎo)致其極易受到腸缺血再灌注損傷的影響，讓肝臟代謝解毒水平顯著下降，增強(qiáng)微循環(huán)阻力，甚至引起肝功能衰竭，其中作用機(jī)制可能與線粒體受損、炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷、細(xì)胞凋亡有關(guān)［3］。因此，探究IIR 患者肝保護(hù)的有效方法尤為重要。黃芪注射液是由中藥材黃芪中提取，具有減少細(xì)胞凋亡、緩解炎癥反應(yīng)、清除自由基等作用［4-5］。為探究黃芪注射液在大鼠腸缺血再灌注肝損傷中的應(yīng)用，本次研究詳細(xì)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9 只成年健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司；SP 免疫組化染色試劑盒，購(gòu)自美國(guó)ZYMED 公司；Bcl-2 兔抗鼠多克隆抗體（N-19，sc-492）及Bax 兔抗鼠單克隆抗體（P-19，sc-526），購(gòu)自SantaCruz 公司，美國(guó)；黃芪注射液，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020999，購(gòu)自：神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，每一支裝2 mL，相當(dāng)于原藥材4 g。

1.3 分組及模型制備

將9 只成年健康Wistar 大鼠隨機(jī)分為3 組，分別為假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（IIR 組）和黃芪注射液組（黃芪組），每組3 只大鼠，3 組按照再灌注時(shí)間劃分為3 個(gè)不同時(shí)相1、3、6 h，3 組每一個(gè)時(shí)項(xiàng)都是1只大鼠。黃芪組大鼠每日給予一次黃芪注射液，劑量6 mL·kg-1，濃度為2 g·mL-1。Sham 組、IIR 組均給予等量生理鹽水，持續(xù)給予7 d。實(shí)驗(yàn)前，全部大鼠均自由飲水，禁食12 h。d 7 給藥1 h 后進(jìn)行麻醉，給予大鼠腹腔注射20% 烏拉坦，劑量1 mg·kg-1。再給予消毒，在大鼠腹部上半身正中位置行一長(zhǎng)度為3 cm 切口，暴露并且游離大鼠腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery，SMA）。Sham 組大鼠暴露且游離SMA，但是不對(duì)SMA 進(jìn)行夾閉。IIR 組及黃芪組大鼠都通過(guò)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾將SMA 夾閉1 h，然后再灌注1、3、6 h 不同時(shí)間將大鼠處死，取其左葉肝組織作為標(biāo)本。

1.4 肝組織Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)水平

利用濃度為10%的中性甲醛對(duì)部分肝左葉進(jìn)行固定，石蠟包埋，具體操作步驟按照SP 免疫組化染色進(jìn)行。在光鏡下進(jìn)行觀察，如果細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或者黃染的顆粒樣，評(píng)判為陽(yáng)性反應(yīng)，而陰性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)不染色。陰性對(duì)照通過(guò)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗。在顯微鏡下每一張肝組織切片均隨機(jī)選擇8～10 個(gè)高倍鏡視野（40×10），通過(guò)MIAS-2000 圖像分析系統(tǒng)評(píng)估陽(yáng)性區(qū)域評(píng)估（IOD），該指標(biāo)衡量陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)多少，檢測(cè)全部標(biāo)本Bax、Bcl-2 表達(dá)水平。

1.5 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)

利用缺口末端標(biāo)注技術(shù)（TUNEL）檢測(cè)肝組織中肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。具體操作方法參照TUNEL 說(shuō)明書操作，陰性對(duì)照并不添加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶，只是添加標(biāo)記液。在光鏡下進(jìn)行觀察，如果細(xì)胞核顯示為棕黃色，則判斷為凋亡細(xì)胞。在顯微鏡下每一張肝組織切片均隨機(jī)選擇8～10 個(gè)高倍鏡視野（40×10），AI 計(jì)算公式如下［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 工具進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，采用單因素方差分析，3 組中兩兩組對(duì)比采用LSD 法處理，不同時(shí)相對(duì)比采用重復(fù)方差分析，P＜0.05 則表示對(duì)比具有明顯差異。

2 結(jié)果

2.1 Bax、Bcl-2 表達(dá)水平

與Sham 組相比，IIR 組與黃芪組再灌注1、3、6 h 3個(gè)不同時(shí)相Bax、Bcl-2 表達(dá)水平均明顯提高（P＜0.05），IIR 組再灌注1、3、6 h 3 個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax 降低，黃芪組3 個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax 水平均升高（P＜0.05）。與IIR 組對(duì)比，黃芪組再灌注1、3、6 h 3 個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax、Bcl-2 都顯著提高，Bax 水平降低（P＜0.05）。同組中不同時(shí)相間對(duì)比無(wú)明顯差異（P＞0.05，Tab.1）。

Tab.1 Expression levels of Bax and Bcl-2 in each group

2.2 AI 表達(dá)水平

與Sham組相比，IIR組與黃芪組再灌注1、3、6 h 3 個(gè)不同時(shí)相AI 均顯著提高（P＜0.05）。與IIR 組對(duì)比，黃芪組3 個(gè)不同時(shí)相AI 都顯著降低（P＜0.05）。IIR 組與黃芪組同組中不同時(shí)相間對(duì)比具有明顯差異（P＜0.05），而且再灌注6 h 最高（Tab.2）。

Tab.2 Expression levels of AI in each group

3 討論

腸道是缺血再灌注損傷敏感部位之一，既可引起腸道組織凋亡，而且可能導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的可能引起多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），因此其被醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是誘發(fā)MODS 重要器官［7］。在解剖學(xué)上，肝臟同時(shí)具有門靜脈、體循環(huán)雙重循環(huán)供血的特征，其中大部分血液都來(lái)源門靜脈，導(dǎo)致肝臟容易受到炎癥介質(zhì)、腸源性毒素、腸缺血等因素的影響［8］。因此，諸多學(xué)者對(duì)于IIR引起的肝損傷進(jìn)行大量研究。

黃芪注射液對(duì)于大鼠腦、視網(wǎng)膜、小腸、肺部等再灌注損傷都具有保護(hù)效果，其作用機(jī)制可能與阻斷鈣超載、清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等途徑有關(guān)。

Bcl-2 家族是與細(xì)胞凋亡的重要基因，Bcl-2/Bax比值對(duì)于細(xì)胞受到刺激后是凋亡還是生存具有決定性的作用。與Sham 組相比，IIR 組與黃芪組3 個(gè)不同時(shí)相Bax、Bcl-2 表達(dá)水平均明顯提高（P＜0.05），IIR 組3個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax 降低，黃芪組3 個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax 水平均升高（P＜0.05）。與IIR 組對(duì)比，黃芪組再灌注1、3、6 h 3 個(gè)不同時(shí)相Bcl-2/Bax、Bcl-2 都顯著提高，Bax 水平降低（P＜0.05）。同組中不同時(shí)相間對(duì)比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這提示，大鼠發(fā)生IIR 后可導(dǎo)致肝損傷，而且Bcl-2、Bax 表達(dá)水平提高，黃芪注射液的作用機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax 表達(dá)，與既往研究一致［9-10］。與Sham 組相比，IIR 組與黃芪組再灌注1、3、6 h 3 個(gè)不同時(shí)相AI 均顯著提高（P＜0.05）。與IIR 組對(duì)比，黃芪組3 個(gè)不同時(shí)相AI 都顯著降低（P＜0.05）。IIR 組與黃芪組同組中不同時(shí)相間對(duì)比具有明顯差異（P＜0.05），而且再灌注6 h 最高。

綜上所述，大鼠發(fā)生IIR 后可導(dǎo)致肝損傷，而且Bcl-2、Bax 表達(dá)水平提高，黃芪注射液的作用機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax 表達(dá)，緩解肝細(xì)胞凋亡，具有肝保護(hù)效果。