龍思琴,喻秀峰,葛宇黎,劉爐香

龍思琴,葛宇黎,劉爐香, 麗水市人民醫(yī)院感染科 浙江省麗水市 323000

喻秀峰, 麗水市人民醫(yī)院急診科 浙江省麗水市 323000

0 引言

脂肪肝分為酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)兩種類型[1].其中NAFLD與肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等代謝性疾病密切相關,因此NAFLD屬于慢性代謝異常性肝臟類疾病[2].NAFLD的突出特征在于病程的持續(xù)性病理改變,從最初(排除明確的損肝因素)機體代謝紊亂所致的肝細胞脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎,隨后發(fā)生肝纖維化和肝硬化,甚至最終可能導致肝細胞肝癌發(fā)生,因此,NAFLD是原發(fā)性肝細胞癌發(fā)生的潛在因素[3].且,NAFLD約影響全球范圍內30%的成年人的身體健康[4].故,NAFLD已成為一個與我們生活密切相關的公共衛(wèi)生問題.盡管已開展了許多用于NAFLD治療策略,但目前尚無特異性針對NAFLD的治療藥物[5].

銀杏內酯B(Ginkgolide B,GB)是從銀杏葉中提取的一種藥理活性最高的二萜內酯類活性單體.GB具有包含抗氧化應激、抗炎、擴血管和維持脂代謝穩(wěn)態(tài)等多種藥理作用[6,7].在肝病領域方面的研究顯示,GB能改善CCl4誘導大鼠的肝臟的炎癥與纖維化[8].基于NAFLD為肝細胞脂代謝紊亂導致的應激性和炎癥性肝損傷[2,3],以及GB的藥理作用[6-8],推測GB可能具有抗NAFLD的作用,而GB對NAFLD的影響和機制尚未見報道.因此,本研究主要探究GB是否在NAFLD中具有肝保護作用以及其機制.

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑與抗體 36只SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(浙)2019-0001],飼養(yǎng)于SPF級動物房(無病原體條件; 12 h光/暗循環(huán); 室溫維持在23-25 ℃; 濕度維持在55%-65%),在給予特殊飲食之前,小鼠隨意飲食和水.銀杏內酯B (貨號:B21581,純度≥98%)購于上海源葉生物科技有限公司; 油紅O染液(貨號:D027)購于上海雅吉生物公司; 白介素6 (interleukin 6,IL-6) ELISA試劑盒(貨號:GRS13-515)購于上海廣銳生物科技有限公司; 白介素1β (interleukin 1β,IL-1β) ELISA試劑盒(貨號:H002)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:H052)、甘油三酯酶(triglyceride,TG)比色法試劑盒(貨號:F001-1-1)和總膽固醇(total cholesterol,TC)比色法試劑盒(貨號:F002-1-1)購于南京建成生物公司; RIPA緩沖液(貨號:P0013C)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號:P0010S)、β-actin抗體(貨號:AF5001)和HRP綴合的二抗(貨號:A0208)購于上海碧云天生物科技有限公司; 真核翻譯起始因子2α亞基(phosphoeukaryotic translation initiation factor-2α,eIF2α,貨號:#9722S)和磷酸化真核翻譯起始因子2α亞基(eukaryotic translation initiation factor-2α,p-eIF2α,貨號:#3398T)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司; 脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS,貨號:sc-8009)和活化轉錄因子4 (activating transcription factor 4,ATF-4,貨號:sc-390063)抗體購于美國Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝小鼠建模:通過高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導法建立NAFLD小鼠模型[9].將小鼠隨機分為正常對照組(normal control,NC)、NC+8 mg/kg GB組、HFD組、HFD+2 mg/kg GB組、HFD+4 mg/kg GB組和HFD+8 mg/kg GB組,每組6只.NC組和NC+8 mg/kg GB組小鼠采用普通飼料喂養(yǎng)10 wk; HFD組、HFD+2 mg/kg GB組、HFD+4 mg/kg GB組和HFD+8 mg/kg GB組采用HFD飼料(60%普通飼料、35%脂肪和5%膽固醇)喂養(yǎng)10 wk.NC+8 mg/kg GB組、HFD+2 mg/kg GB組、HFD+4 mg/kg GB組和HFD+8 mg/kg GB組小鼠在喂養(yǎng)第7-10周每天分別腹腔注射8 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg和8 mg/kg GB,NC組和HFD組在同時間段給予腹腔注射等體積的生理鹽水.在第10周末,稱重后,麻醉小鼠后處死,斷頭取血,解剖取肝臟并稱重.

1.2.2 血生化檢測:將血液樣本置于真空抗凝管中靜置10 min,在室溫下以3000 r/min離心20 min以收集血清,然后用全自動生化儀分析血清中谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、TG和TC水平.

1.2.3 HE染色:將肝臟組織在4%甲醛溶液中浸泡過夜,然后包埋固定于石蠟,并制作5 μm后肝切片.肝切片經常規(guī)脫蠟復水后,行HE染色,顯微鏡下觀察肝組織病理學的變化并拍照.

1.2.4 油紅O染色:將肝組織制成10 μm厚的切片,蒸餾水洗滌后將切片用60%異丙醇中漂洗20-30 s,滴加油紅O染液并室溫孵育10 min后,用60%異丙醇稍洗去多余染液,再用蒸餾水洗除異丙醇,蘇木素染核,并用1%鹽酸酒精分化.最后用水漂洗10 min,室溫晾干,顯微鏡下觀察肝組織脂質蓄積情況并拍照.

1.2.5 ELISA檢測:取肝組織經RIPA勻漿后,收取勻漿液并用BCA法進行蛋白定量.取肝組織勻漿液,并根據試劑盒說明書的步驟,進行ELISA檢測,反應顯色后用96孔板式分光光度計(DLB-96C型,石家莊點晶電子科技有限公司)在波長450 nm處測量吸光度值,并根據標準品繪制標準曲線,計算出單位mg蛋白中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量.

1.2.6 比色法檢測:取經BCA法蛋白定量后的肝組織勻漿液樣品,按照試劑盒說明書的步驟,進行反應,反應完成后用分光光度計在波長505 nm處測量吸光度值,并根據標準品繪制標準曲線,計算出單位mg蛋白中TG和TC的含量.

1.2.7 Western blot檢測:取經BCA法蛋白定量后的肝組織勻漿液樣品,并取等量(30 mg)蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到PVDF膜上.封閉膜后,4 ℃孵育1:1000稀釋比例的一抗(eIF2α、p-eIF2α、ATF-4、FAS和β-actin)過夜,用TBST洗膜3次,將膜與1:3000稀釋比例的HRP綴合的二抗孵育1 h.化學發(fā)光法顯影后,利用Image J軟件進行灰度值分析,以β-actin灰度值對目的條帶灰度值進行標準歸一化處理.

統(tǒng)計學處理數據表示為mean±SD,并利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析.數據間的兩兩比較采用單因素方差分事后的Bonferroni-t檢驗.P＜0.05時被認為具有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 GB抑制HFD誘導的肝損傷和肝組織病理學改變全自動生化儀檢測血清中ALT和AST活性用于評估肝損傷,結果(圖1A和B)顯示,HFD組血清中ALT和AST活性明顯升高(P＜0.01),而GB治療能明顯抑制HFD誘導的ALT和AST活性升高(P＜0.05或P＜0.01),提示GB能抑制HFD誘導的肝損傷.進一步計算了肝體比,結果(圖1C)顯示,與NC組比較,HFD組肝體比明顯增加(P＜0.01); 與HFD組比較,HFD+4 mg/kg GB組和HFD+8 mg/kg GB組肝體比明顯降低(P＜0.05).通過HE染色直接的觀察肝組織病理學改變,結果(圖1D)顯示,HFD組肝組織出現大量肝細胞空泡樣改變,且伴有炎性細胞侵潤(箭頭); 而在GB治療組中HFD導致的肝病理學改變明顯減輕.

2.2 GB抑制HFD誘導的肝組織炎性反應 通過ELISA檢測IL-6、IL-1β和TNF-α以評估肝組織中炎性反應,結果(圖2A-C)顯示,與NC組比較,HFD組肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P＜0.01); 與HFD組比較,GB能以劑量依賴性降低HFD誘導的IL-6、IL-1β和TNF-α水平(P＜0.05或P＜0.01).

圖1 銀杏內酯B抑制高脂飲食誘導的肝損傷和肝組織病理學改變. A和B：各組血清中谷丙轉氨酶(A)和谷草轉氨酶(B)活性的統(tǒng)計結果；C：各組肝體比統(tǒng)計結果；D：各組肝組織HE染色圖,比例尺=100 μm.NC：正常對照；HFD：高脂飲食；GB：銀杏內酯B；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶.bP＜0.01,與正常對照組比較；cP＜0.05,dP＜0.01,與高脂飲食組比較；n=6.

圖2 銀杏內酯B抑制高脂飲食誘導的肝組織炎性反應. A-C：各組肝組織中白介素-6 (A)、白介素-1β (B)和腫瘤壞死因子-α (C)水平的統(tǒng)計結果.NC：正常對照；HFD：高脂飲食；GB：銀杏內酯B；IF：白介素；TNF：腫瘤壞死因子.bP＜0.01,與正常對照組比較；cP＜0.05,dP＜0.01,與高脂飲食組比較；n=6.

2.3 GB降低HFD誘導的肝脂質蓄積 結果(圖3A和B)顯示,HFD組血清中TG和TC含量明顯升高(P＜0.01),而GB治療能明顯抑制HFD誘導的TG和TC含量升高; 這一現象同樣在肝組織中呈現(圖3C和D).用油紅O染色觀察結果(圖3E)顯示,在HFD組因肝組織大量空泡脂肪樣變性,脂滴匯合成大的脂滴(紅色),大量積聚于肝細胞; GB治療能明顯改善HFD誘導的肝組織的肝細胞中脂質蓄積; 對脂滴計數,結果(圖3F)顯示,HFD組肝組織脂滴數明顯增加(P＜0.01),而GB治療能濃度依賴性減少HFD誘導的肝組織細胞中脂滴積聚(P＜0.01).

2.4 GB減弱HFD誘導的內質網應激水平 Western blot結果(圖4)顯示,與NC組比較,HFD組肝組織中p-eIF2α、ATF-4和FAS表達水平明顯升高(P＜0.01); 與HFD組比較,GB治療能抑制HFD誘導的肝組織中p-eIF2α、ATF-4和FAS高表達(P＜0.01).

3 討論

肝臟中肝細胞脂肪變性與脂質積聚為NAFLD的關鍵性病理變化,也是觸發(fā)后續(xù)肝功能減退與肝損傷的關鍵因素[3].文獻表明[10,11],HFD誘發(fā)的代謝紊亂可使得TC與TG水平的異常升高,特別是TC與TG異常沉積于肝臟,能促使肝細胞脂肪性變性,并且TC與TG的持續(xù)積累能促使肝臟對炎癥敏感,促進NAFLD的進展.本研究顯示,GB能降低HFD誘導小鼠血清和肝組織中TC與TG含量,并減少HFD導致的肝組織中肝細胞脂肪變性和肝細胞中脂質蓄積.脂質沉積造成的肝損傷和肝功能減退是NAFLD進展的驅動因素.血清ALT和AST是NAFLD生化檢查用于評估肝損傷和肝功能的重要指標[12],長期HFD會引起肝損傷和肝功能減退并升高ALT和AST的水平[13].本研究結果顯示,GB可顯著降低HFD誘導的小鼠血清中ALT和AST水平,提示GB可減輕HFD誘導的肝損傷.另有,研究[14]報道,HFD誘導的肝臟脂肪變性與慢性肝臟炎癥密切相關,肝臟脂肪變性增加了肝臟細胞對促炎性因子介導的損傷的敏感性,并且持續(xù)的慢性炎癥進一步加劇了NAFLD進展.因此,本研究進一步觀察GB是否對NAFLD小鼠肝內肝細胞炎癥反應起保護作用,結果顯示,GB能改善HFD引起的小鼠肝組織內炎性侵潤的病理變化,并降低肝組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌,表明GB可有效抑制HFD導致的肝臟炎癥反應.

內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應是導致NAFLD肝損傷的主要毒性事件之一[15].低氧、脂質過度負荷、炎癥等病理因素可打破內質網穩(wěn)態(tài),引發(fā)肝細胞中ERS[15,16],其中,eIF2α在ERS中發(fā)揮重要作用.有研究[17]發(fā)現激活eIF2α/ATF-4信號能通過上調FAS的表達促進乳腺上皮細胞的脂源性分化和細胞內脂質合成.Oyadomari等[18]在動物實驗中觀察到ERS激動劑誘導的小鼠表現為脂肪肝,而eIF2α去磷酸化后,小鼠的脂肪肝明顯改善.另外,p-eIF2α可以上調ATF-4的表達,進而激活核內的固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c、乙酰輔酶A羧化酶2和FAS等脂質合成相關基因的表達[19],ATF-4基因敲除小鼠能抵抗HFD誘導的肥胖、高甘油三脂血癥和NAFLD[20].以上證據表明了eIF2α/ATF-4在NAFLD肝細胞脂質合成和代謝中的作用.本研究結果也顯示,在HFD誘導的NAFLD小鼠肝組織中p-eIF2α、ATF-4和FAS高表達,而GB能抑制HFD誘導的小鼠肝組織中的高水平p-eIF2α、ATF-4和FAS,說明GB可通過減弱ERS進而減輕HFD誘導的NAFLD.

綜上所述,HFD誘導的NAFLD小鼠表現為肝細胞彌漫大泡性脂肪變性和過量脂質異常沉積于脂肪變性的肝細胞且伴隨肝損傷、肝臟炎癥和肝ERS反應; 而GB能改善HFD導致的肝組織中肝細胞脂肪變性和肝細胞中脂質蓄積并減少肝臟炎癥和減弱肝ERS反應,提示GB可作為抗NAFLD的潛在藥物.

文章亮點

實驗背景

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)發(fā)病率呈逐年增加趨勢,其不僅危害患者的身體健康,且其還具體誘發(fā)肝癌的風險.而目前尚無特異性治療NAFLD的藥物,因此,繼續(xù)研究或篩選NAFLD的潛在治療劑是目前一項刻不容緩的科研任務.

實驗動機

銀杏內酯B (ginkgolide B,GB)具有抗炎、抗氧化和維持脂代謝穩(wěn)態(tài)的作用,提示GB可能具有改善NAFLD的作用.

實驗目標

探討GB對NAFLD小鼠肝損傷和脂肪變性的影響,并分析其中的機制.

實驗方法

用高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導法建立NAFLD小鼠模型,并給予低、中和高劑量的GB治療.收集小鼠血液樣品,生化法檢測血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、甘油三酯酶(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的水平.收集小鼠肝組織樣品,HE染色觀察病理形態(tài)學改變; 油紅O染色觀察脂質蓄積情況; ELISA法檢測白介素-6、白介素-1β和腫瘤壞死因子-α的水平; 比色法檢測TG和TC的水平; Western blot檢測內質網應激關鍵蛋白表達.

圖3 銀杏內酯B降低高脂飲食誘導的肝脂質蓄積.A：各組血清中甘油三酯酶(triglyceride,TG)含量的統(tǒng)計結果；B：各組血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)含量的統(tǒng)計結果；C和D：各組肝組織中TG (C)和TC (D)含量的統(tǒng)計結果；E：各組肝組織油紅O染色圖(比例尺=100 μm)；F：脂滴計數的統(tǒng)計結果.NC：正常對照；HFD：高脂飲食；GB：銀杏內酯B；TG：甘油三酯酶；TC：總膽固醇.bP＜0.01,與正常對照組比較；cP＜0.05,dP＜0.01,與高脂飲食組比較；n=6.

圖4 銀杏內酯B減弱高脂飲食誘導的內質網應激水平.A：Western blot檢測各組肝組織中磷酸化真核翻譯起始因子2α亞基和真核翻譯起始因子2α亞基的蛋白表達；B：Western blot檢測各組肝組織中活化轉錄因子4的蛋白表達；C：Western blot檢測各組肝組織中脂肪酸合酶的蛋白表達.NC：正常對照；HFD：高脂飲食；GB：銀杏內酯B；eIF2α：真核翻譯起始因子2α亞基；p-eIF2α：磷酸化真核翻譯起始因子2α亞基；ATF-4：活化轉錄因子4；FAS：脂肪酸合酶.bP＜0.01,與NC組比較；cP＜0.05,dP＜0.01,與HFD組比較；n=6.

實驗結果

GB改善了HFD導致的肝臟脂肪變性,降低了肝損傷和炎癥反應,并維持了肝細胞中脂代謝穩(wěn)態(tài).另外,GB減弱了HFD導致的內質網應激反應.

實驗結論

GB能通過減輕肝損傷、脂肪變性和減弱內質網應激來改善HFD誘導的小鼠NAFLD.

展望前景

GB具有改善HFD導致的小鼠肝細胞脂肪變性和脂質異常蓄積并減弱肝臟炎癥和內質網應激反應的作用,提示GB可作為潛在的抗NAFLD的藥物.