李 芳,陳子豪,檀碧波,李 勇

李芳, 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科 河北省石家莊市 050011

陳子豪,檀碧波,李勇, 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科 河北省石家莊市050011

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)在全球最常見的癌癥類型中位列第四,死亡率位列第三[1].全世界每年約有700000例新確診GC患者[2],嚴重影響著人類健康.許多GC患者診斷時即為晚期,盡管在該病的診斷和治療方面取得了許多進展,如手術(shù)方式的改進、輔助放療及術(shù)前新輔助化療的進行,增加了可切除性GC的機會[3],但GC的預后仍然很差,5年生存率偏低[4].因此,尋找能夠準確預測或反映胃癌個體癌癥風險、判斷不良預后的新型生物標志物對患者實施個體化精準診治策略具有重要意義.以往認為腫瘤是由蛋白質(zhì)編碼基因發(fā)生突變引起的,近年來發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)能夠在表觀遺傳學水平如染色體重塑、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平調(diào)控基因的表達,轉(zhuǎn)錄后可導致基因沉默或激活,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可通過調(diào)控血管生成相關(guān)因子的表達、內(nèi)皮細胞的增殖、遷移,最終影響血管生成[5-8](表1).LncRNA因其在人類疾病中的作用而受到越來越多的關(guān)注,lncRNA的異常表達也與GC密切相關(guān),通過參與GC細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為,影響GC進展及預后.傳統(tǒng)的化療由于腫瘤細胞的多藥耐藥而療效有限,腫瘤細胞的耐藥機制尚不清楚.因此胃癌相關(guān)lncRNA可作為GC早期診斷、預測預后、探討耐藥機制的潛在生物標志物.

1 LncRNA簡介

真核生物基因組可能轉(zhuǎn)錄幾種類型的RNA,包括蛋白編碼mRNA、短和長非編碼RNA.從這些RNA中,發(fā)現(xiàn)人類細胞中的非編碼RNA比編碼RNA多.根據(jù)DNA基因組中,76%的人類基因組DNA轉(zhuǎn)錄成RNA,僅有2%的基因組DNA被翻譯成蛋白,證明存在大量的非編碼RNA.近年來,對小分子RNA (micro RNA,miRNA)、小干擾RNA (small interference RNA,siRNA)、核仁小RNAs等短鏈非編碼RNA的研究較多.與此同時,lncRNA正受到越來越多的關(guān)注,lncRNA不僅被認為是基因組的副產(chǎn)品,而且具有豐富的防御細胞功能,許多功能與人類疾病有關(guān)[9].

LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的的非編碼RNA.大多數(shù)lncRNA是由RNA聚合酶II合成的.根據(jù)lncRNA在基因組上為主將其分為5類:(1)反義型; (2)增強子型; (3)基因內(nèi)型; (4)基因間型; (5)雙向型.LncRNA在染色質(zhì)、DNA、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,影響mRNA的轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯、輸出、輸入和穩(wěn)定性,從而影響各種疾病的發(fā)生和預后.調(diào)控機制可能包括干擾編碼基因的翻譯,抑制聚合酶II的活性,促進轉(zhuǎn)錄后修飾,與功能蛋白結(jié)合,或作為小分子RNA的前體物質(zhì)與染色體結(jié)合,調(diào)控信號通路[10].與短鏈非編碼RNA相比,lncRNA的機制功能多樣化,增加了該基因家族的復雜性,而短鏈非編碼RNA多被認為是基因調(diào)控的結(jié)果[8](圖1).目前可能是由于lncRNA的低表達水平和組織特異性,對其功能缺乏深入了解.通過像DNA元素百科全書、哺乳動物基因組的功能注釋、基因型-組織表達和GENCODE這樣的基因組計劃,已經(jīng)預測出了超過60000個lncRNA,一些已經(jīng)被證實與某些疾病密切相關(guān).LncRNA通過與轉(zhuǎn)錄起始位點的相互作用、作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子或作為蛋白質(zhì)支架,已被證明具有轉(zhuǎn)錄因子招募者的功能.LncRNA可能作為分子誘餌捕獲轉(zhuǎn)錄因子,從而限制轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點的結(jié)合.除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外,lncRNA還通過調(diào)控mRNA剪接、抑制轉(zhuǎn)譯、充當miRNA海綿或競爭miRNA在mRNA上的結(jié)合位點,從而在mRNA的加工、成熟和穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[11].一些lncRNA也可以編碼小肽,表明這些lncRNA可以作為一個雙功能轉(zhuǎn)錄本,即作為lncRNA或蛋白模板[12].近年來,越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在致癌過程中發(fā)揮重要作用[13,14].

2 LncRNA檢測技術(shù)簡述

2.1 LncRNA檢測現(xiàn)狀 LncRNA與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用,發(fā)揮功能,使其復雜性提高到一個新的水平.傳統(tǒng)的mRNA功能研究方法在lncRNA研究中效率低下,由于lncRNA在表達上有特異性高峰的特征,拷貝數(shù)也很低,這些特征使檢測變得極為困難.雖然某些lncRNA組織特異性的出現(xiàn)有助于生物標志物的發(fā)展,但一些情況下若出現(xiàn)在細胞核內(nèi),再利用RNA干擾進行功能研究時可能會造成困難.因此,研究lncRNA的方法應該是高效的,具有更高的靶向性和分辨率,在分子水平上具有高度的可操作性.

表1 長鏈非編碼RNA具有代表性的表觀遺傳調(diào)控功能

圖1 長鏈非編碼RNA結(jié)構(gòu)介導的表觀遺傳調(diào)控模型. A：長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)與不同配體蛋白相互作用的變構(gòu)效應；B：LncRNA作為分子支架招募多種調(diào)控蛋白并與之結(jié)合；C：LncRNA通過功能區(qū)域重復元件介導組蛋白修飾.LncRNA：長鏈非編碼RNA.

對lncRNA的研究主要手段是對細胞或組織提取的RNA進行定量和定性分析,常用方法有PCR、芯片技術(shù)、測序技術(shù)、Northern blot等[15].傳統(tǒng)RNA原位雜交選擇放射性標記、熒光標記、生物素標記的RNA探針,檢測特異性及靈敏性較差.針對RNA長度超過300堿基的lncRNA可采用RNAscope技術(shù),它是基于獨特的探針設計和信號放大的原位雜交方法,顯著提高了檢測的特異性和靈敏度,已經(jīng)被廣泛用于lncRNA的研究.

2.2 LncRNA檢測方法的選擇 (1)采用lncRNA芯片、RNA-seq測序等方法進行l(wèi)ncRNA表達譜篩選分析.RNA-seq測序?qū)τ诘拓S度lncRNA無法進行準確定量,芯片比RNA-seq更適合低豐度lncRNA表達譜的檢測; (2)通過生物信息學的方法篩選出具有表達差異的lncRNA,預測lncRNA靶基因; (3)通過構(gòu)建lncRNA過表達載體進行過表達功能試驗的驗證; (4)通過siRNA、shRNA等方法沉默lncRNA,敲低lncRNA表達后檢測其對相關(guān)疾病信號通路相關(guān)基因表達的影響和對細胞增值、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移的影響; (5)通過RNA pull-down、RNA免疫沉淀、ChIRP-seq等技術(shù)檢測與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA及蛋白質(zhì); (6)通過構(gòu)建動物移植瘤模型實驗,導入lncRNA表達質(zhì)?；騭iRNA后,通過PCR、免疫組織化學、Western blot等方法檢測相關(guān)指標的變化,從而揭示lncRNA在疾病發(fā)生及進展中的作用機制.

3 LncRNA與GC

3.1 LncRNA與GC發(fā)生相關(guān)潛在標志物 大量研究表明,lncRNA在腫瘤發(fā)生和腫瘤進展中起著關(guān)鍵作用.特別是lncRNA表達異常可能伴隨DNA損傷、免疫逃逸以及癌細胞的細胞代謝紊亂.LncRNA還與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及對細胞干性的調(diào)控密切相關(guān).LncRNA目前在GC中研究尚少,研究顯示其異常表達與GC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預后等相關(guān),有可能作為GC診斷和預后的潛在標志物,成為新的治療靶點.Cao等[16]利用生物信息學方法檢測顯示,有88種lncRNA在GC組織中存在異常表達.LncRNA的異常表達與GC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),通過多種分子機制實現(xiàn).某些lncRNA可以與DNA、RNA 和蛋白質(zhì)相互作用,參與GC的發(fā)生和發(fā)展,如MALAT1、GHET1和TINCR等可通過堿基互補配對與mRNA結(jié)合或與RNA結(jié)合蛋白形成復合物,介導mRNA的穩(wěn)定性和拼接.還有些lncRNA,如ANRIL、GACAT3、H19、MEG3和TUSC7通過與miRNAs 結(jié)合發(fā)揮生物學作用.ANRIL、H19、HOTAIR、MALAT1和PVT1,可以通過招募組蛋白修飾物,抑制靶基因的順式或反式轉(zhuǎn)錄.CCAT1、GAPLINC、GAS5、H19、MEG3和PWRN1分別通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子p53、癌基因c-myc發(fā)揮致癌或抑癌作用[17-19].細胞凋亡被認為是抑制細胞生長的另一種途徑,caspase-3和-9是細胞凋亡的兩個關(guān)鍵成員.TP73-AS1在GC組織標本和細胞中轉(zhuǎn)錄水平升高,其高轉(zhuǎn)錄與腫瘤大小偏大和TNM分期偏晚密切相關(guān),提示TP73-AS1可能是GC的致瘤因子; TP73-AS1基因的敲除顯著降低了GC細胞的生長和集落形成能力; TP73-AS1沉默后Bax、caspase-3和-9升高,而Bcl-2降低,TP73-AS1可以通過Bcl-2/Caspase-3途徑保護細胞凋亡[20].HOTAIR在GC中表達水平越高,存活率越低.GC細胞株轉(zhuǎn)染HOTAIR后,HOTAIR水平顯著升高,miR-618水平明顯下降,而轉(zhuǎn)染si-HOTAIR-2則導致HOTAIR下調(diào),miR-618上調(diào),由此預測miR-618是HOTAIR的直接靶點,在GC組織和細胞中被下調(diào)[21].PVT1在胃發(fā)育不良及GC組織中的表達顯著升高,與GC發(fā)生關(guān)系密切[22].

TP73-AS1、HOTAIR、PVT1等lncRNA在GC發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用,其發(fā)揮作用的分子學機制有待進一步研究.

3.2 LncRNA與GC進展相關(guān)潛在標志物 LncRNA與miRNA及其靶基因之間內(nèi)源性競爭的調(diào)控模式與GC的發(fā)展進程密切相關(guān),如bc032469、GAPLINC和HOTAIR等.HOXA11-AS通過與PRC2/LSD1/DNMT1相互作用和海綿吸附miR-1297促進細胞生長和GC的侵襲潛能; HOXA11-AS可能與WDR5促進β-catenin轉(zhuǎn)錄,結(jié)合EZH2p21抑制轉(zhuǎn)錄,并通過與STAU1交互誘導KLF2 mRNA降解,促進GC生長和轉(zhuǎn)移[23,24].lnc00153在GC中表達增加,通過激活EGFR/PI3K/Akt通路促進腫瘤生長和遷移[25].lnc01939低表達與GC進展呈正相關(guān),高表達的患者總生存和無進展生存期預后更好,lnc01939是GC患者的獨立保護因素,可能在GC的進展和轉(zhuǎn)移中起到抑制作用[26].lnc00473是一個基因間lncRNA,位于人類染色體6q27,是幽門螺桿菌感染的人胃上皮細胞和組織中嚴重失調(diào)的lncRNA之一[27],高表達與組織學類型分化差、臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[28],過表達與臨床進展相關(guān).RP11-789C1.1被認為是一種抑癌因子,在GC中下調(diào),作為miRNA-5003-3p的內(nèi)源競爭RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)海綿,并通過EMT進一步在GC的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用,提示可能作為GC轉(zhuǎn)移的潛在標志物[29].M26317在61.17%的GC組織中表達上調(diào),與患者年齡、腫瘤大小、Lauren分型、浸潤深度、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、預后均有顯著相關(guān)性,提示M26317在GC發(fā)生發(fā)展過程中影響腫瘤的進展[30].在GC細胞中發(fā)現(xiàn)LOC285194的顯著衰減和Wnt信號通路的強烈激活,沉默LOC285194可促進GC細胞集落形成、增殖、侵襲和遷移,抑制細胞凋亡,且LOC285194的下調(diào)通過激活Wnt信號轉(zhuǎn)導促進了GC的進展,而過表達LOC285194則可抑制GC的發(fā)展[31].LINP1可下調(diào)RBM5,在體內(nèi)外均能顯著促進GC的生長,抑制其凋亡[32].Ftx通過上調(diào)HK2水平促進GC進展[33],IGFL2-AS1的下調(diào)抑制了GC的發(fā)展,IGFL2-AS1/miR-802/ARPP19軸在GC的進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[34].TEAD4調(diào)控的MNX1-AS1部分通過抑制EZH2/BTG2和激活miR-6785-5p/BCL2導致GC進展[35].CR749391通過海綿miR-181a作為調(diào)節(jié)KLF6表達的ceRNA,可能是GC中的關(guān)鍵調(diào)控因子,CR749391的下調(diào)可能是GC進展相關(guān)的新標志物[36].GCRL1在體內(nèi)外均可調(diào)節(jié)胃細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,通過海綿化miR-885-3p促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移,從而在GC細胞中積極調(diào)節(jié)CDK4,預示了包括GCRL1、miR-885-3p和CDK4GC進展的新調(diào)控軸,也可能成為GC潛在的治療靶點[37].

LncRNA通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,干擾其與基因啟動子區(qū)的結(jié)合,調(diào)控轉(zhuǎn)錄; 作為分子海綿,吸附miRNA,抑制其與mRNA結(jié)合; 通過調(diào)控蛋白活性,影響基因轉(zhuǎn)錄和表達; 與mRNA結(jié)合,抑制翻譯,影響剪切,影響mRNA的穩(wěn)定性,lncRNA的失調(diào)可能與GC惡性進展密切相關(guān)[38].3.3 LncRNA與GC預后相關(guān)潛在標志物 LncRNA的多樣性和異質(zhì)性使得腫瘤發(fā)生過程更加復雜.lnc00473高表達的GC患者總生存期明顯縮短,高表達是GC患者總生存期的獨立不良預后因素.沉默lnc00473對GC細胞活力沒有影響,但通過調(diào)節(jié)MMP2、MMP9、ecin和Vimentin的表達,抑制了GC細胞的遷移和侵襲.lnc00473水平與TCGA數(shù)據(jù)庫中GC患者無病生存時間和總生存時間呈負相關(guān)[28].lnc00483通過上調(diào)SPAG9和激活MAPKs在體內(nèi)外GC模型中促進增殖和抑制凋亡,對GC的診斷和預后具有相當大的預測價值[39].UFC1過表達可促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲,沉默后則抑制; 通過海綿吸附miR-498和作為lin28b的ceRNA發(fā)揮其致癌活性,UFC1表達水平高與GC患者病情進展及預后不良有關(guān)[40].AFAP1-AS1過表達與GC患者生存時間縮短有關(guān),并促進GC細胞惡性生物學行為,部分顯著提高GC細胞E-cadherin蛋白、降低N-cadherin蛋白表達水平,調(diào)節(jié)EMT過程,進而影響GC預后[41,42].MEG3在GC中表達水平明顯降低,過表達可抑制GC的腫瘤進展,下調(diào)MEG3與GC預后不良有關(guān)[43,44].SNHG8通過靶向miR-491/PDGFRA軸促進了GC細胞的增殖和侵襲,從而影響GC預后[45].GAPLINC作為miR-211-3p的分子海綿調(diào)控CD44,增強腫瘤的遷移和侵襲,過表達增加了G2/M細胞周期階段的細胞數(shù)量,增強了體內(nèi)腫瘤的生長,對細胞增殖和細胞周期進程的增強則依賴于MAPK1,對GC預后預測具有重要價值[46].

LncRNA通過靶向調(diào)控miRNA,從而進一步調(diào)控靶基因影響胃癌預后,因此,靶向lncRNA可能是一種較好的腫瘤治療方法.

3.4 LncRNA與GC耐藥相關(guān)潛在標志物 目前術(shù)前和術(shù)后聯(lián)合化療治療方案的實施,提高了GC患者的整體生存率,但耐藥仍然是有效進行癌癥化療的障礙之一[47].順鉑是進展期胃癌患者的主要化療藥物.LncRNA 已被證實參與胃癌自噬相關(guān)耐藥(順鉑或長春新堿)過程[48,49],抑制自噬可以增加GC細胞對順鉑的敏感性,降低GC細胞的多藥耐藥[50].HULC在耐藥GC細胞中高表達,促進了耐藥GC細胞的自噬,增強GC耐藥細胞對順鉑的耐藥性[51].MALAT1通過調(diào)節(jié)順鉑耐藥GC細胞中miR-30b/ATG5軸,誘導自噬,增強順鉑耐藥[52].UCA1通過影響凋亡通路調(diào)節(jié)GC中阿霉素的化學敏感性,敲低UCA1通過上調(diào)RARP和下調(diào)Bcl-2來加速阿霉素誘導的GC細胞凋亡[53].ANRIL在順鉑耐藥和5-氟尿嘧啶耐藥的GC組織和細胞中上調(diào),ANRIL沉默可通過下調(diào)MDR1和MRP1逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[54].SNHG5在順鉑耐藥GC細胞中高表達,通過介導凋亡和耐藥相關(guān)基因調(diào)控GC順鉑耐藥[53].miR-145-5p可直接靶向多藥耐藥蛋白1,增加化療藥物的毒性.MACC1-AS1通過拮抗miR-145-5p促進干細胞形成和耐藥[55].AK022798參與了順鉑抗性SGC7901/DDP和BGC823/DDP的形成過程,其表達受Notch 1調(diào)控,Notch 1增強了細胞的耐藥能力,加重了腫瘤細胞的惡化,通過干擾AK022798的表達,MRP1和P-gp的表達及細胞增殖下降,SGC7901/DDP和BGC823/DDP細胞的凋亡增加,靶向AK022798表達可能為晚期GC的治療提供一種新的方法[56].PVT1可以激活抗凋亡因子Bcl-2的表達,在PVT1高表達的GC患者中,PVT1增強了GC對5-Fu的耐藥性,基于非5-Fu的化療方案可能是更好的治療選擇[57].miR-27b通過miR-27b/CCNG1/P53/miR-508-5p軸參與GC細胞多耐藥的調(diào)控.UCA1與miR-27b在GC組織中的表達呈負相關(guān),UCA1的下調(diào)恢復了miR-27b在GC細胞中的表達,UCA1-miR-27b軸參與調(diào)控GC細胞的化學敏感性[58],通過滅活THOR/SOX9調(diào)節(jié)軸可以減弱SCG7901-ddp細胞對順鉑的耐藥,THOR在順鉑耐藥中的作用,為靶向THOR治療GC新發(fā)或獲得性耐藥患者提供了新的選擇[59].HOTAIR作為內(nèi)源性海綿,通過競爭性結(jié)合和抑制miR-126的表達,激活PI3K/AKT/MRP1通路的表達和活性,誘導miR-126靶向VEGFA和PIK3R2在GC細胞中的表達.HOTAIR過表達可通過誘導腫瘤細胞增殖和減少凋亡,促進GC順鉑耐藥[60].

目前化療藥物耐藥是限制GC臨床治療效果的一項重要因素,從lncRNA著手攻克腫瘤耐藥問題成為治療熱點.隨著越來越多GC耐藥相關(guān)lncRNA陸續(xù)被研究發(fā)現(xiàn),但仍處于基礎(chǔ)研究階段,如何將lncRNA耐藥相關(guān)的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床領(lǐng)域的應用還需要多中心、大數(shù)據(jù)的進一步研究.

4 結(jié)論

由于高通量測序技術(shù)、基因組圖譜以及生物信息學工具的快速發(fā)展,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了lncRNAs的大量信息.LncRNA在GC發(fā)生中發(fā)揮著致癌/抑癌基因的作用,通過多種相關(guān)分子機制及信號通路影響著GC的進展及預后.化療耐藥是臨床治療GC面臨的困境,直接影響著患者的生存.某些lncRNA可增加或減少對抗腫瘤藥物的敏感性,由于多數(shù)研究目前集中在體外細胞學和動物學實驗,對人體腫瘤的具體應用和臨床實施還存在著諸多挑戰(zhàn).早發(fā)現(xiàn)、早治療、有效改善化療耐藥仍然是提高GC患者生存率的關(guān)鍵,有望通過檢測GC發(fā)生、進展及預后相關(guān)的lncRNA潛在標志物,預測個體化GC診治策略,實現(xiàn)臨床實踐中的精準治療.