劉利思,楊 婷，葉展鴻，孫 澎，王 剛，黃世光

S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8, S100A8)是S100蛋白家族的重要成員之一，主要由兩個不同螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)配基手型(EF-hand,EF手型)組成的低分子量(10.8 ku)鈣結(jié)合蛋白。S100A8通過對中性粒細胞的趨化作用、激活炎性細胞和炎性因子的產(chǎn)生、介導(dǎo)細胞內(nèi)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]。S100A8蛋白可特異性地表達于內(nèi)皮細胞、表皮細胞及髓系細胞，因此又稱為髓細胞相關(guān)蛋白-8(myeloid-related protein-8,MRP-8)，其功能取決于機體在特定炎癥環(huán)境中分泌的介質(zhì)及參與其識別的受體等[2]。S100A8在通常情況下可通過鈣離子依賴性方式與S100A9形成S100A8/S100A9異源性二聚體發(fā)揮其生物功能[3]。研究表明，在生理情況下S100A8/S100A9無炎癥活性，但在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等炎性因子的刺激下能誘導(dǎo)其炎癥活性[4]。雖然異源性二聚體形式是鈣衛(wèi)蛋白最常見存在的形式，但其單體S100A8或S100A9也可獨立存在并各自發(fā)揮其生物學(xué)功能[3]。在慢性牙周炎的發(fā)展過程中，細菌及其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物能夠刺激巨噬細胞(macrophages, m?)活化，導(dǎo)致活化的m?分泌大量的促炎因子，在宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。CD68是分布于細胞表面的分子量為110 ku的跨膜糖蛋白，在單核細胞表面較少，但向巨噬細胞轉(zhuǎn)化后表達CD68，因此CD68是最常用于標記巨噬細胞的表面標記物[5-6]。以往研究主要聚集于鈣衛(wèi)蛋白二聚體的作用，而關(guān)于鈣衛(wèi)蛋白單體的研究報道較少。我們通過免疫熒光雙染色(double immunofluorescence，DIF)，觀察每組不同炎癥程度慢性牙周炎牙齦組織標本中CD68-S100A8雙陽性細胞的表達情況，探討CD68-S100A8雙陽性細胞在慢性牙周炎中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例選擇 2018年7月—2018年12月在中山市人民醫(yī)院牙周科和口腔頜面外科門診部就診的自愿接受本研究的60例受試者，年齡16～65歲,其中男26例，平均年齡(29.00±14.57)歲；女34例，平均年齡(33.00±13.02)歲，患有糖尿病及其他系統(tǒng)性疾病者需排除。臨床牙周炎患者選擇的標準依據(jù)1999年美國牙周病學(xué)會公布的牙周病新分類指南[7]。實驗符合人體試驗委員會制定的倫理學(xué)標準并獲得批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 分組及取材 ①正常對照組20例(16～45歲)：牙齦指數(shù)(gingival index，GI)=0，探診深度(probing depth，PD)≤3 mm， X線片顯示無牙槽骨吸收(圖1A)；②輕度牙周炎組20例(24～60歲)：取自因需要接受臨床牙冠延長術(shù)者，GI=1，PD≤4 mm，臨床附著喪失(clinical attachment loss, CAL)為1～2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收≤根長1/3(圖1B)；③重度牙周炎組20例(31～65歲)：取自無法保留或預(yù)后差的需拔牙的重度牙周炎患者，GI=3，PD>6 mm，CAL≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收>根長1/2，甚至達到根長的2/3，牙齒松動Ⅲ度(圖1C)。各組間受試者年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異。

A:正常對照組；B：輕度牙周炎組；C：重度牙周炎組

圖1 各組X線影像

Fig.1 X-ray images of each group

1.2 實驗方法

1.2.1 組織標本的預(yù)備與處理 牙齦組織標本于4%多聚甲醛溶液中固定時間48 h以上，隨后脫水、石蠟包埋，制成5 μm厚頰舌向牙齦組織連續(xù)切片用于后續(xù)染色。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE) 在光學(xué)顯微鏡下對牙齦組織進行觀察。由2名病理醫(yī)師進行盲法觀察，參照Huang等[8]的炎癥程度評分標準對牙齦組織的炎癥細胞浸潤情況進行評分，取平均值。0分:無炎癥細胞浸潤;1分:輕度，牙齦組織中局部見炎癥細胞呈小灶狀浸潤;2分:中度，牙齦組織中見灶狀及片狀浸潤的炎癥細胞;3分:重度，牙齦組織中可見彌漫性浸潤的炎癥細胞。

1.2.3 S100A8-CD68雙陽性細胞免疫熒光雙染色 Ⅰ抗：CD68抗體(Abcam),稀釋濃度為1∶100；S100A8抗體(北京博奧森)，稀釋濃度1∶200；Ⅱ抗：山羊抗小鼠鼠IgG(H+L)Alex Flour?555和山羊抗兔IgG(H+L) Alex Flour?488(cell signaling technology)，稀釋濃度1∶200。組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，在修復(fù)盒經(jīng)微波爐加熱修復(fù)抗原；遮光條件下牛血清白蛋白(BSA)孵育、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育行熒光染色，封片并立即在熒光顯微鏡下觀察拍照。紅色熒光為CD68陽性表達，綠色熒光為S100A8陽性表達，其定位于細胞質(zhì)或細胞膜，同一視野m?與S100A8重疊后為橘黃色熒光，藍色熒光信號表達為DAPI染出細胞核。染色切片置于熒光顯微鏡下，400倍下隨機選取5個視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0圖像處理軟件(美國Mdia Cybernetics)計算陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差的形式表示，采用Spss 25.0軟件進行統(tǒng)計分析處理。采用Kruskal-Wallis檢驗對各組牙齦組織炎癥程度評分進行比較；采用完全隨機設(shè)計單因素方差分析(one-way ANOVA)對3組標本的CD68-S100A8雙陽性細胞數(shù)進行組間比較。設(shè)α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

正常對照組結(jié)締組織中罕見有炎癥細胞浸潤(圖2A)；輕度牙周炎組可見少量炎性細胞呈散在分布(圖2B)；重度牙周炎組見上皮釘突增生，固有層中炎癥細胞大量聚集(圖2C)。慢性牙周炎組的炎癥程度評分顯著高于正常對照組(P<0.05)(圖3)。

A:正常對照組；B：輕度牙周炎組；C：重度牙周炎組

圖2 各組牙齦組織的組織學(xué)觀察(HE染色 ×400)

Fig.2 Representative photomicrographs of human gingival tissues (HE staining ×400)

*：與正常對照組比較，P<0.05;#：與輕度牙周炎組比較，P<0.05

圖3 各組牙齦組織炎癥程度評分比較

Fig.3 Comparison of inflammatory scores of gingival tissues in each group

2.2 CD68和S100A8免疫熒光雙染色結(jié)果

m?為CD68+，在3組標本中均可被檢出，各組牙齦組織CD68-S100A8雙陽性細胞免疫熒光雙染色結(jié)果見圖4。紅色熒光信號表達是CD68(圖4A、E、I)，綠色熒光信號表達是S100A8(圖4B、F、J)，橘黃色熒光表達是在同一視野下紅色熒光與綠色熒光重疊(圖4D、H、L)，細胞核顯示為藍色熒光(圖4C、G、K)。正常對照組：CD68-S100A8雙陽性m?在牙齦組織中少量散在分布(圖4A、B、C、D)；輕度牙周炎組：CD68-S100A8雙陽性m?數(shù)量在牙齦組織中明顯增加(圖4E、F、G、H)；重度牙周炎組：CD68-S100A8雙陽性m?在牙齦組織中可見大量聚集(圖4I、J、K、L)；各組牙齦組織標本陰性對照未見熒光表達。

各組牙齦組織中，CD68-S100A8雙陽性m?密度(個/mm2)見圖5。3組標本陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.074，P<0.05)；牙周炎組中CD68-S100A8雙陽性m?數(shù)量與正常對照組相比較明顯上升(P<0.05)；其中，重度牙周炎組CD68-S100A8雙陽性m?數(shù)量顯著多于輕度牙周炎組(P<0.05)。

3 討 論

慢性牙周炎是牙周致病菌引起的感染性疾病。在牙周炎的進展中，牙周致病菌可直接損傷牙周組織，也可通過免疫炎癥反應(yīng)造成組織的損害。炎癥過程中產(chǎn)生的細胞因子和酶類如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)等可造成牙槽骨的吸收和有機基質(zhì)的降解[9]。研究發(fā)現(xiàn)在人慢性牙周炎牙齦組織中，有大量中性粒細胞、淋巴細胞及m?等炎癥細胞浸潤[10]。m?是一種具有吞噬殺傷功能的固有免疫細胞，也是存在于慢性牙周炎患者牙周組織中重要的炎癥細胞之一[11]。牙周組織中的m?來源于血液中的單核細胞，作為炎癥細胞在維持抗炎和促炎的免疫平衡中發(fā)揮重要作用，吞噬作用是防止細菌侵入牙周組織的一道防線，在防御的同時吞噬

A～D：正常對照組；E～H：輕度牙周炎組；I～L：重度牙周炎組。A、E、I為CD68+陽性染色；B、F、J為S100A8陽性染色；C、G、K為DAPI染色；D、H、L為CD68-S100A8雙陽性m?熒光染色

圖4 各組牙齦組織中CD68-S100A8雙陽性m?觀察(DIF染色 ×400)

Fig.4 Representative photomicrographs of CD68-S100A8 double positive m? in human gingival tissues (DIF staining ×400)

*：與正常對照組比較，P<0.05;#：與輕度牙周炎組比較，P<0.05

圖5 各組牙齦組織標本中雙陽性細胞密度的比較

Fig.5 Comparison of double positive cell density in gingival tissue of each group

細胞過度的免疫反應(yīng)可能會破壞牙周組織導(dǎo)致附著喪失和牙槽骨吸收[12]。m?可由于組織內(nèi)環(huán)境的改變和炎癥因子的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同類型的m?，根據(jù)表型和功能特征主要分為兩種：經(jīng)典活化的m? (classically activated macrophage,caMphi)即M1型和替代性活化的m?(alternative activated macrophages，aaMphi)即M2型[13]。研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎進程中，浸潤在牙周組織中的m?主要為M1型，同時也觀察到少量M2型,并可釋放少量抗炎因子如白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，但其表達水平顯著低于促炎因子，故M1型m?可能在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起主要作用[14]。CD68是單核細胞譜系、循環(huán)巨噬細胞和組織巨噬細胞中高度特異性表達的一種蛋白質(zhì)，可作為巨噬細胞的標志。在炎癥環(huán)境中炎性因子的驅(qū)化作用下，外周血中單核細胞遷移到感染組織分化為巨噬細胞參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部CD68+水平升高[5-6]。實驗以CD68+作為m?的標記，通過DIF發(fā)現(xiàn)CD68+的表達水平與牙周炎癥程度正相關(guān)，提示巨噬細胞參與牙周炎癥，其表達水平很大程度決定牙槽骨破壞的水平，結(jié)果與Radvar等[15]一致。

在炎癥環(huán)境中，特定的上皮細胞、活化的中性粒細胞及m?可釋放鈣衛(wèi)蛋白，鈣衛(wèi)蛋白被認為是炎癥性疾病的標志物[16]。研究發(fā)現(xiàn)與牙周健康者比較，慢性牙周炎患者的唾液、牙齦組織、齦溝液及血清中鈣衛(wèi)蛋白(S100A8/S100A9)的表達增高，且單體S100A8和S100A9在牙周炎進展中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[17-18]。S100A8在調(diào)控炎癥發(fā)展過程中具有抗炎和促炎雙重調(diào)節(jié)作用，且被發(fā)現(xiàn)與侵襲性牙周炎個體易感性有關(guān)[19]。鄭云飛等[20]通過細胞遷移侵襲實驗技術(shù)及劃痕法對牙周膜細胞遷移活性進行檢測發(fā)現(xiàn)，在牙周炎活動期高濃度的S100A8可以抑制牙周膜細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而參與組織破壞；在疾病后期或者經(jīng)過牙周治療后，較低濃度的S100A8卻可以促進牙周膜細胞遷移，參與組織修復(fù)。在特定條件下如組織發(fā)生嚴重炎癥時，釋放到胞外的S100A8能刺激炎癥細胞釋放炎癥因子如TNF-α、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等，直接參與炎癥疾病的過程并阻礙組織的恢復(fù)，加重炎癥程度，同時又可通過活化Toll樣受體4(Toll-like receptors, TLR4)以激活m?FcγRI和FcγRIV受體的表達[21]。TLR4是在Toll樣受體家族里最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一，主要識別革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖結(jié)構(gòu)，因此在以革蘭陰性厭氧菌如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)為主要致病菌的慢性牙周炎中發(fā)揮重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在人牙齦成纖維細胞中TLR4可能是鈣衛(wèi)蛋白的主要靶受體，鈣衛(wèi)蛋白介導(dǎo)的TLR4信號在轉(zhuǎn)錄因子核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活中發(fā)揮重要作用[23]。查何[24]研究發(fā)現(xiàn)LPS和S100A8單獨或共同刺激m?后TLR4受體的表達水平較對照組升高，其中LPS和S100A8共同刺激效果最明顯，同時S100A8通過激活TLR4/ NF-κB信號通路，可促進m?分泌炎性因子IL-1β及TNF-α從而造成組織損傷。然而，Thorey等[25]研究發(fā)現(xiàn)，S100A8能通過清除氧化物，防止過度氧化對機體造成損傷以促進傷口愈合，發(fā)揮抗炎作用。Naruishi等[26]研究發(fā)現(xiàn)與S100A8相比，S100A9和鈣衛(wèi)蛋白二聚體可顯著增加牙齦成纖維細胞中IL-6、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和TNF-α的產(chǎn)生并參與牙周炎的炎癥反應(yīng)，提示S100A8的促炎作用可能相對較弱。但另有研究發(fā)現(xiàn)，在局部炎癥部位，聚集的高濃度S100A8可導(dǎo)致組織修復(fù)延遲，表明S100A8可能產(chǎn)生促炎作用參與組織破壞，同時發(fā)現(xiàn)S100A9促炎作用并不明顯[27]。本實驗結(jié)果顯示，慢性牙周炎牙齦組織中CD68-S100A8雙陽性m?密度顯著高于正常組，活化或被招募的m?遷移到炎癥部位分泌S100A8，導(dǎo)致炎癥局部S100A8水平升高，提示m?(CD68+)參與S100A8的激活及釋放可直接造成牙周組織破壞并阻礙組織修復(fù)，從而促進牙周炎癥進展。迄今為止，S100A8在慢性牙周炎具體的作用機制不詳，仍有待進一步的研究。

本實驗采用DIF，觀察人不同炎癥程度慢性牙周炎牙齦組織中S100A8在m?的表達情況，結(jié)果顯示S100A8和m?在同一細胞共定位，進一步證實S100A8和m?關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，人慢性牙周炎牙齦組織的m?表達S100A8，重度牙周炎患者的牙齦組織中的 m?S100A8的表達顯著高于輕度牙周炎組，提示CD68-S100A8雙陽性m?可能參與慢性牙周炎的免疫調(diào)節(jié)過程。我們的結(jié)果提示控制人慢性牙周炎組織中S100A8的合成或者調(diào)節(jié)m?的功能也許可成為阻止慢性牙周炎發(fā)展的一個新的途徑。