夏翊博，于金華

根尖牙乳頭干細胞(stem cell from apical papilla, SCAPs)是存在于牙根未發(fā)育完全牙齒根尖乳頭的一種間充質干細胞[1]，其具有較強的分化能力，研究認為其是一種有潛力用于組織再生修復的種子細胞[2-4]。

甲狀腺激素(thyroid hormones，TH)是一種重要的激素，其參與調控發(fā)育、代謝等重要過程。甲狀腺功能亢進(以下簡稱甲亢)是在臨床上十分常見的內分泌疾病，有著較大的患者群體[5-6]。血清中游離TH水平過高會產(chǎn)生一系列不利影響。臨床、實驗室及流行病學研究表明，甲亢可導致各種硬組織發(fā)育、代謝異常，如：顱縫早閉、牙齒發(fā)育異常等[7-8]。這提示我們，血清中游離TH水平過高可能會影響干細胞成牙/骨向分化。然而，高濃度的TH對 SCAPs的成牙/骨向分化能力是否有影響罕見文獻報道。本實驗將驗證TH的主要生物活性形式——3,5,3′-三碘甲腺原氨酸(3,5,3′-triiodothyronine, T3)[9]對SCAPs成牙/骨向分化的影響，并對其機制進行初步的探究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

3,5,3′-三碘甲腺原氨酸(Sigma,美國)，Ⅰ型膠原酶(Gbico，美國)，胰酶(Gbico，美國)，α-MEM(Hyclone，美國)，胎牛血清(Gbico，美國)，青-鏈霉素雙抗(Gbico，美國)，CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)，堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(建成，中國)，BCA試劑盒(建成，中國)，BCIP/NBT顯色試劑盒(碧云天，中國)，RIPA裂解液(碧云天，中國)，SDS- PAGE 凝膠試劑盒(凱基，中國),SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Super-Signal West Pico化學發(fā)光底物(Thermo，美國)，茜素紅染色液(Sigma,美國)，油紅染色液(Solarbio，中國)，阿新藍染色液(Solarbio，中國)，成骨誘導液(cyagen，美國)，成脂誘導液(cyagen，美國)，成骨誘導液(cyagen，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SCAPs原代培養(yǎng) 于南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院頜面外科門診收集拔除的根尖未發(fā)育完全的健康牙齒(經(jīng)患者知情同意)，使用含1%雙抗的PBS清洗離體牙2次，眼科剪分離牙乳頭并置于α-MEM培養(yǎng)基中剪碎，加入Ⅰ型膠原酶和胰酶，轉移至37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，每5 min 輕震1次，20 min后加入FBS終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含2%雙抗完全培養(yǎng)基，吹打均勻后轉入中皿，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后初次換液，以后每2 d換液，待細胞融合至80%傳代，取狀態(tài)良好的3～5代細胞進行實驗。

1.2.2 細胞干性鑒定 細胞接種于6孔板，加入礦化誘導液培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗兩遍，4%多聚甲醛固定15 min，ddH2O漂洗2遍，茜素紅染液(pH=4.2)染色；加入成脂誘導液培養(yǎng)25 d，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，油紅O染液染色；加入成軟骨誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)30 d，4%多聚甲醛固定后，包埋劑包埋，切片，制片，阿新藍染色。鏡下觀察并拍照。

1.2.3 T3條件培養(yǎng)基配制 將T3粉末溶解于1 mol/L NaOH溶液配制成濃度為1×10-3mol/L的T3母液，-80 ℃保存。使用前配制成為含所需濃度T3的條件培養(yǎng)基。

1.2.4 最佳刺激濃度的篩選 將SCAPs接種于6孔板。配制T3濃度為1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L的條件培養(yǎng)基分別加入，每2 d換液，5 d后棄原培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，吸干PBS后加入含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)的RIPA裂解液處理10 min，刮下細胞轉移至EP管，超聲裂解，12 000 r/min、4 ℃離心，按說明書程序測各組ALP活性，BCA法測蛋白濃度。剩余上清調平濃度后4∶1加入上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，-80 ℃保存。按產(chǎn)品說明書配制SDS-PAGE，每泳道上樣10 μL，60 V恒壓電泳至條帶分離至膠底部，300 mA轉膜，PVDF膜轉移至5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，一抗封閉4 ℃過夜；次日搖床復溫度1 h，PBST漂洗10 min 3次，二抗室溫封閉1 h，含吐溫的Tris緩沖液(tris buffered saline Tween，TBST)漂洗10 min 3次，加入化學發(fā)光液，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光。獲取圖像后使用image J軟件進行灰度分析。選取ALP表達最高的T3濃度作為實驗濃度進行后續(xù)實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測增殖能力 將SCAPs接種于96孔板，細胞貼壁后無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h。以完全培養(yǎng)基處理組作為對照組，T3條件培養(yǎng)基處理組作為實驗組，每2 d換液，培養(yǎng)0、1、3、5、7、9 d后吸去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10% CCK-8液，37 ℃ 孵育2 h后將液體轉移至新的96孔板，酶標儀測波長450 nm處OD值，并繪制增殖曲線。

1.2.6 實時定量RT-PCR檢測成骨相關基因表達 將SCAPs接種于中皿中，T3條件培養(yǎng)基處理0、3、7 d后，按照說明書提取總RNA并進行逆轉錄。DSPP、RUNX2、DMP1、OSX等目的基因和內參基因GAPDH由上海生工合成(表1)。使用定量PCR酶混合物試劑盒和實時熒光定量PCR儀進行檢測，條件如下:95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。利用2-ΔΔCt法計算各指標的相對量。

1.2.7 Western Blot檢測成牙/骨相關蛋白表達 將SCAPs接種于中皿，T3條件培養(yǎng)基處理0、3、7 d后，按實驗1.2.4步驟提取總蛋白并檢測成牙/骨向分化相關蛋白的表達并進行灰度分析。

1.2.8 堿性磷酸酶(ALP)染色 將SCAPs接種于12孔板，細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，分別加入完全培養(yǎng)基、T3條件培養(yǎng)基，隔日換液，培養(yǎng)5 d，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min后吸去固定液，ddH2O漂洗兩遍，NBT/BCIP染液按說明書比例配制后加入，避光染色30 min。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primers used in RT-PCR

1.2.9 Western Blot檢測MAPK通路相關蛋白 將SCAPs接種于中皿中，T3條件培養(yǎng)基處理后，按實驗1.2.4提取總蛋白并檢測MAPK通路關蛋白表達并進行灰度分析。

1.2.10 U0126處理后檢測牙/骨向分化相關蛋白表達 將SCAPs接種于中皿中，T3、T3+U0126、U0126條件培養(yǎng)基處理后，按實驗1.2.4提取總蛋白檢測成牙/骨向分化相關蛋白表達量并進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0進行。兩組間數(shù)據(jù)的比較使用student’st檢驗，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞培養(yǎng)及干性鑒定

倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)3 d后，可見梭形細胞聚集在組織塊周圍(圖1)。所分離培養(yǎng)細胞可以誘導成骨、成軟骨和成脂分化(圖2)，即該細胞為有多向分化能力的干細胞。

A：原代培養(yǎng)的SCAPs；B：第二代SCAPs

圖1 SCAPs的顯微鏡下圖片( ×200)

Fig.1 SCAPs under microscope( ×200)

2.2 T3對SCAPs ALP表達的影響

用1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L的條件培養(yǎng)基刺激SCAPs 5 d后， 測定ALP表達及活性并繪制柱狀圖。結果顯示1×10-9mol/L T3條件培

A：茜素紅染色；B：油紅染色；C：阿新藍染色

圖2 誘導SCAPs多向分化( ×200)

Fig.2 Multi-directional differentiation of SCAPs( ×200)

養(yǎng)基顯著提高ALP表達及活性，且高于其他各組(P<0.001)(圖3)。

**:P<0.01；***:P<0.001；Con：對照組

A：Western Blot檢測堿性磷酸酶表達；B：A的定量分析；C：堿性磷酸酶活性

圖3 不同濃度T3處理SCAPs 5 d后的ALP表達量和活性

Fig.3 The ALP expression and activity of SCAPs after treated with different concentrations of T3 for 5 d

2.3 T3 對SCAPs細胞增殖的影響

CCK-8結果表明對照組與T3組SCAPs增殖能力沒有顯著差異(P>0.05)(圖4)。

2.4 T3對SCAPs成牙/骨向分化的影響

T3條件培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，堿性磷酸酶染色表明其ALP表達高于對照組(圖5)。實時定量RT-PCR與Western Blot結果表明，細胞在T3條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、7 d后，成牙/骨相關基因/蛋白：DSPP/DSPP、RUNX2/RUNX2、DMP1/DMP1、OSX/OSX表達顯著提高(P<0.05)(圖6、7)。

圖4 T3對SCAPs增殖能力的影響Fig.4 Effect of T3 on the proliferation of SCAPs

圖5 T3處理5 d后堿性磷酸酶染色Fig.5 Images of alkaline phosphatase staining after treated with T3 for 5 d

*:P<0.05；**:P<0.01

圖6 成牙/骨相關基因表達

Fig.6 Experessions of the related odonto/ostegenic gene

***:P<0.001

A：Western Blot檢測成牙/骨向分化相關蛋白；B：A的定量分析

圖7 T3對SCAPs成牙/骨向分化相關蛋白的影響

Fig.7 Effect of T3 on the odonto/ostegenic related proteins of SCAPs

2.5 T3 對MAPK 通路的影響

T3條件培養(yǎng)基處理0、15、30、60 min后，檢測MAPK通路相關蛋白表達的變化，并進行灰度分析。結果顯示T3處理后，ERK的磷酸化水平提高(P<0.001)(圖8)。

***:P<0.001

A：Western Blot檢測MAPK信號通路相關蛋白；B：A的定量分析

圖8 T3對MAPK信號通路的影響

Fig.8 Effect of T3 on the MAPK signal pathway

2.6 U0126對成牙成骨向分化相關蛋白表達的影響

在使用ERK抑制劑U0126處理后，原本由T3所引起的成牙/骨向分化相關蛋白DSPP、RUNX2、DMP1、OSX的升高被抑制(P<0.001)(圖9)。

***:P<0.001

A：Western Blot檢測成牙/骨向分化相關蛋白；B：A的定量分析

圖9 U0126對SCAPs成牙/骨向分化相關蛋白的影響

Fig.9 Effect of U0126 on the odonto/ostegenic related proteins of SCAPs

3 討 論

組織再生技術是一種極富潛力治療硬組織缺損的方式，然而其廣泛應用于臨床尚有很多問題需要解決。臨床上所面對的患者常常不處于理想的生理狀態(tài)，而某些異常生理狀態(tài)對干細胞的影響尚不明確。內分泌疾病在臨床上十分常見，研究表明：糖尿病會造成牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)增殖分化能力變弱[10]；雌激素的缺乏會抑制DPSCs的成骨分化[11]；高濃度的甲狀旁腺素會促進SCAPs的成骨[12]。這提示我們各種常見內分泌疾病都有可能對種子細胞的分化產(chǎn)生有利或不利影響。因此，這些干細胞在進行臨床應用前，對各種內分泌因素的影響進行研究是十分必要的。

甲狀腺素對骨的發(fā)育和維持具有重要意義，但是在不同條件下，可能會對細胞產(chǎn)生不同影響。膠原蛋白是骨礦化沉積的骨架，有研究者用高濃度的T3刺激骨細胞，發(fā)現(xiàn)其通過上調相關基因的表達促進Ⅰ型膠原的表達和交聯(lián)[13]，而在軟骨細胞的實驗中也有類似的結果[14]。有學者使用T3處理MC3T3-E1細胞，發(fā)現(xiàn)其多項成骨相關指標表達均有所上調[15]。動物實驗表明宮內過量的甲狀腺素暴露會導致小鼠顱縫早閉，這可能是由于甲狀腺素促進顱縫處的成骨細胞過度分化所導致的[7]。同時也有研究認為T3可能不利于骨的生成[16]。張翔等對家兔連續(xù)注射左旋甲狀腺素8周后，牙槽骨密度發(fā)生明顯降低[17]。

本實驗通過1×10-9mol/L T3對SCAPs進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該濃度的T3可以促進SCAPs的成骨向分化。ALP是成骨分化的早期指標[18]，我們通過檢測發(fā)現(xiàn)1×10-9mol/L T3對SCAPs堿性磷酸酶活性及表達的提高幅度最大，因此選擇該濃度進行后續(xù)實驗[19-20]。CCK-8結果表明該濃度T3條件培養(yǎng)基對SCAPs的增殖沒有明顯影響。Western Blot和RT-PCR結果顯示DSPP、RUNX2、DMP1、OSX等成牙成骨相關指標的mRNA和蛋白表達均呈現(xiàn)上升趨勢。牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)在牙本質形成過程中起到重要作用[21]；runt相關轉錄因子-2(runt-related transcription factor-2，RUNX2)是一種轉錄因子，其在牙、骨等硬組織的形成過程中起到關鍵作用，它通過下游的成骨相關轉錄因子(osterix，OSX)調節(jié)磷灰石的形成[22-23]。骨基質酸性蛋白1(dentin matrixacidic phosphoprotein 1，DMP1)是牙本質織礦化、代謝的基礎，實驗發(fā)現(xiàn)DMP1基因的缺失會導致礦化異?；蛉毕輀24]。綜合以上結果我們認為1×10-9mol/L T3可以促進SCAPs的牙/骨向分化。

信號通路在細胞的各種生物學行為中扮演重要角色，許多研究都證實MAPK信號通路對牙源性干細胞的成牙和(或)成骨向分化有著調控作用[25-26]。ERK是MAPK信號通路的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)T3通過ERK/MAPK通路調節(jié)多種細胞的生物學行為，如細胞的增殖、自噬和分化等[27-28]。MAPK通路通過磷酸化完成信號傳遞，本實驗中，ERK的磷酸化水平在T3刺激后15 min顯著提高，提示ERK信號通路被激活。U0126是ERK的抑制劑[29]，其通過抑制ERK的上游分子MEK的活性發(fā)揮抑制效應，它是被廣泛用作ERK研究的藥理學工具。當使用U0126處理后，由T3所引起的成牙/骨向分化相關蛋白表達量的升高被抑制。以上結果提示T3促進SCAPs的成牙/骨向分化的作用可能與ERK密切相關。

本實驗探討了T3對SCAPs成骨向分化的影響，發(fā)現(xiàn)1×10-9mol/L T3能夠增強SCAPs成骨向分化的能力，并初步探討了這個過程與MAPK通路的聯(lián)系。這從一定程度上說明SCAPs作為種子細胞運用于甲亢患者的硬組織再生的可行性，為進一步深入探索牙齒、骨骼等硬組織的再生修復提供一定的參考，為后續(xù)的研究和臨床應用提供實驗依據(jù)。