楊東明，楊利峰，趙德明，周向梅

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種嚴重危害機體神經系統(tǒng)的退行性病變。 其病變過程主要表現為黑質紋狀體發(fā)生嚴重的壞死、缺失，引起多巴胺能神經元退化，最終導致患者表現出典型臨床癥狀，即一系列運動失調癥狀(肌肉強直、震顫麻痹、運動障礙)及伴有消化與內分泌紊亂癥狀[1-2]。該病病因復雜，病程緩慢，給研究其具體發(fā)生機制造成困難。

PD 相關動物模型種類多樣，發(fā)展迅速。 現有PD 動物模型按照其處理方式主要分為以下三類：神經毒素模型(neurotoxic models)、轉基因模型(genetic models)與二者連用模型。 不同種類的PD動物模型為研究PD 相關作用機制及治療手段提供了有力幫助，具有重要意義。 本文著眼于現有PD動物模型相關研究進展，梳理了不同PD 動物模型的特點，討論了不同動物種類在PD 模型中的主要特征，比較了動物模型與PD 患者的臨床差異，旨在為進一步深入開發(fā)PD 動物模型提供參考。

1 神經毒素模型(neurotoxic models)

神經毒素模型是最早使用在PD 研究中的動物模型，也是目前最常用來評價PD 治療效果的手段之一。 該類模型較其他模型優(yōu)勢明顯，以其相對簡單的操作與較低的成本，受到了研究者的青睞，在實際研究中使用較為廣泛。 目前使用最多的神經毒素主要為：6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、1-甲 基-4-苯 基-1，2，3，6-四 氫 吡 啶(1-methyL-4-phenyL-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)、農藥類神經毒素。 其具體作用機制主要是通過抑制神經細胞的呼吸復合物I，從而導致一系列類PD 病變[3]。 當該類物質作用于動物機體后，會迅速引起黑質、紋狀體的嚴重變性，導致機體產生十分強烈的運動失調癥狀；但這些運動癥狀與PD患者的運動癥狀具有較大差異。 此外，由于其病程十分迅速，且病變主要為多巴胺能神經元壞死、缺失，所以該類動物模型一般不會觀察到PD 典型病理變化，即病變突觸核蛋白在神經系統(tǒng)中的大量沉積[4]。 因此，該類模型大多反應晚期、長期的PD 狀態(tài)，適合研究黑質、紋狀體內多巴胺能神經元的退行性變化過程及治療手段的恢復進程[5]。

1.1 6-羥 基 多 巴 胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)

6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種結構類似于兒茶酚胺的物質，于1960 年首次用于PD 動物模型的研究中[6]。 該物質具有親水性，無法直接穿透血腦屏障，使用時須通過特定的定位程序，將該物質直接注射在目標區(qū)域內，一般為黑質、紋狀體、內側前腦束。 其具體作用機制為：該物質迅速引發(fā)非酶促氧化反應，抑制膜轉運蛋白功能；導致大量氧化物質與神經遞質蓄積，抑制呼吸復合物I 的相關功能，破壞線粒體的正常運轉，進一步導致多巴胺能神經元壞死、缺失，使機體神經系統(tǒng)出現退行性現象[7]。該模型的特點是病程迅速，缺少漸進性病變與突觸核蛋白沉積現象。 使用該物質時，不同的注射方式通常會產生不同的病理變化與臨床癥狀。 當注射在紋狀體時，神經癥狀通常表現較為緩慢，病程較輕，但當注射在黑質或內側前腦束時，神經癥狀表現迅速，病程較重，可見明顯的細胞變性、壞死[8]；當單側注射時，其運動癥狀較為明顯且一般不會出現雙側運動障礙，利于實驗者觀察，并且通常不會導致脂質代謝紊亂、失語癥狀、焦慮癥與嗅覺失靈，安全性較高[9]，而雙側注射則不然，所以該模型通常選擇單邊注射，以期達到必要的實驗結果。 目前，該模型主要用于PD 的細胞、分子水平研究，治療效果評價等方面。 例如，在該模型中，觀察者研究發(fā)現基底神經節(jié)的谷氨酸轉移水平顯著增加；黑質、紋狀體內的突觸可塑性由于該區(qū)域多巴胺能神經元的缺失而顯著改變[10-11]；左旋多巴、深層或雙側腦部刺激等治療手段均可通過恢復黑質、紋狀體的突觸傳遞功能，而改善運動癥狀[12]。

1.2 MPTP

MPTP 主要破壞多巴胺能神經元，是一種高親脂性、呼吸復合物I 抑制劑。 它可以輕松穿過血腦屏障，作用于大腦特定區(qū)域，導致運動癥狀。 該物質無毒，可全身給藥，獲得實驗性PD 模型[13]。 其作用機制為：MPTP 與星形膠質細胞中的單胺酶B結合并氧化，最終形成有毒物質MPP+；MPP+通過相應轉運蛋白進入多巴胺能神經元中積聚，當到達一定量后，該物質通過囊泡轉運蛋白進入突觸小泡，最終抑制呼吸復合物I 的功能，干擾線粒體電子傳遞鏈作用，最終導致ATP 合成下降，線粒體損傷[14]。 該模型最大特點為：病程漸進且與PD 患者臨床癥狀最為吻合；可觀察到突觸核蛋白沉積現象，而這一特點是目前大多數PD 動物模型所不具有的。 不同動物種類具有不同的MPTP 敏感性。 靈長類動物較嚙齒動物敏感性較高；嚙齒動物中，小鼠敏感性最高，并且由于小鼠飼養(yǎng)條件簡單，成本較低且操作簡單，故MTPT 小鼠模型使用最為廣泛[15]。 此外，不同注射方法也會導致不同的臨床現象。 單次高劑量腦內注射或重復低劑量腹膜內注射通常會導致黑質紋狀體產生明顯的多巴胺能神經元病變及較為顯著的運動癥狀，而低劑量注射則可觀察到漸進性多巴胺能神經元的損傷與相應的運動癥狀[16-18]；不論是何種劑量，MTPT 導致的運動癥狀一般是可通過行為學標準進行評估。

1.3 魚藤酮

魚藤酮是一種廣泛使用于農業(yè)生產的除草劑、殺蟲劑與除螨劑，屬于類胡蘿卜素神經毒素類物質[19]。 該物質最早發(fā)現于熱帶植物中，具有高度親脂性，極易穿過血腦屏障，其主要特征是進入多巴胺能神經元不依賴多巴胺轉運受體。 進入神經元細胞后，該物質會主要作用于線粒體呼吸鏈復合物I，抑制有關蛋白酶活性，增加ROS 含量，使線粒體處于氧化應激狀態(tài)，進而降低多巴胺與谷胱甘肽代謝水平，增加脂質過氧化反應，加劇細胞氧化損傷[20-21]。 研究證明，魚藤酮在不同實驗條件下的致病速度也不盡相同，存在較大差異。 體外實驗表明：魚藤酮會顯著引起細胞凋亡與內質網應激反應，其導致病變的速度十分迅速；而當體內靜脈注射后，其作用速度相對緩慢，長時間作用后，會出現較為顯著的黑質紋狀體多巴胺能神經元壞死與突觸核蛋白沉積及典型的運動癥狀，如運動遲緩，肌肉強直，體位不穩(wěn)，步態(tài)不穩(wěn)等[22]。 此外，體內注射還可見明顯的鐵離子沉積與小膠質細胞增生。 研究還表明，不同的注射方式會產生不同的病理現象[23]。 通常所采用的經脈注射會導致高死亡率，產生顯著多巴胺能神經元壞死與典型運動癥狀，但其病理現象不可重復，具有個體差異；當采用雙側注射時，動物也會表現多巴胺能神經元壞死，并同時伴有明顯運動失調與機體僵直，且通過左旋多巴治療后，可緩解上述癥狀；而當胃內給藥時，魚藤酮會導致突觸核蛋白最先沉積在胃神經叢中，并逐步轉移到迷走神經背側核，最終侵害中樞神經，而該現象也直接支持了PD 疾病起源于腸道的假說[24]。總的來說，魚藤酮模型使用廣泛，可較為全面地復制PD 病理癥狀與運動特征，以其操作簡單，成本低廉是該模型的主要優(yōu)點，但該物質引發(fā)高死亡率、非典型性PD 癥狀是該模型的缺點[24-25]。

1.4 百草枯

百草枯是一種毒性極大的除草劑，主要是以1-1-二甲基-4-4-聯吡啶陽離子鹽為化學結構的物質，與MPP+結構極為相似，但該類物質不能透過血腦屏障，主要通過氨基酸轉運受體進入大腦，通過激活諸如死亡受體途徑、線粒體信號途徑、內質網應激途徑等多種途徑造成神經細胞凋亡，加速神經元自噬，最終導致神經元壞死[26-27]。 臨床研究發(fā)現：長期注射該物質后，小鼠會表現出顯著的運動癥狀，大鼠則會表現典型的焦慮與嗅覺障礙等癥狀。 該物質進入神經細胞后，通過氧化應激反應，產生大量ROS；同時，該物質還會破壞谷胱甘肽的氧化還原平衡，使得具有毒性作用的谷胱甘肽大量堆積，最終破壞了細胞的抗氧化機制，使得細胞代謝紊亂。 值得注意的是，百草枯對線粒體復合物I的親和力較低，其造成神經毒性作用不會抑制線粒體復合物I 的作用[28]。 雖然該物質對黑質紋狀體多巴胺能神經元毒性作用機制目前尚未研究清晰，但多項研究表明，靜脈注射百草枯會導致運動功能障礙，多巴胺能神經元壞死(其壞死程度與注射劑量有關)，紋狀體神經纖維缺失，但不會改變紋狀體神經節(jié)釋放多巴胺的含量[29-30]。 進一步研究表明：注射高劑量的百草枯會通過氨基酸轉運受體進入多巴胺能神經元細胞中，同時通過有機陽離子轉運受體進入非多巴胺能神經元細胞中，最終導致嚴重的神經細胞死亡，且該損傷現象并非只局限在多巴胺能神經元中[31]。 百草枯動物模型的最大優(yōu)點在于該模型可模擬α-突觸核蛋白過表達與沉積現象，并最終表現沉積在黑質紋狀體的多巴胺能神經元中，而這一現象與PD 患者的臨床表現最為貼近[32]。

1.5 其他神經毒性物質

除了上述神經毒性物質外，其他常見的神經毒性物質還包括代森錳、三氯乙烯、苯丙胺類精神興奮劑等。 代森錳可抑制呼吸復合物Ⅲ功能[33]。 該物質與百草枯組合使用可顯著導致黑質體內多巴胺能神經壞死、缺失[34]。 最新研究發(fā)現三氯乙烯可導致嚙齒動物紋狀體內多巴胺能神經元損傷，模擬PD 相關癥狀[35]。 苯丙胺類精神興奮劑具有極強的神經毒性，可顯著造成神經元損傷與壞死。 其作用機制主要是其極強的促單胺釋放與抑制單胺吸收的能力，最終導致神經纖維的損傷與血清毒素的增加。 苯丙胺類精神興奮劑模型可用于兒茶酚胺能神經元的損傷過程及易感性，但在PD 研究中該模型使用較少[36]。

2 轉基因模型

隨著基因技術的逐步推廣與深入，基因技術造模研究的深入開發(fā)與應用在諸多疾病的機制研究中發(fā)揮了重要作用。 近年來，越來越多與PD 相關的遺傳因素被發(fā)現，研究者通過使用遺傳學的相關方法，對特定物種進行PD 相關基因修飾，可制造出與PD 相關的轉基因動物模型[37]。 目前常用的制備手段主要為基因敲除與轉基因技術。

有關PD 遺傳基因的研究發(fā)現：干擾或調控與線粒體和能量相關的特定基因會導致PD 發(fā)生，并通過大量基因分析技術包括連鎖不平衡分析、家系連鎖分析和全基因組掃描等，由此推動與PD 相關的20 個相關基因與25 個遺傳因素的深入研究。 目前，可將PD 相關基因劃分為“PARK”(18)和“非PARK”(＞20)基因。 迄今為止，已有8 個基因位點的基因序列被克隆，包括與常染色體顯性遺傳PD相關基因(α-突觸核蛋白、LRRK2、UCH-L1)，與常染色體隱性遺傳PD 相關基因(Parkin、PINK1、DJ-1、HTRA2、ATP13A2)兩類[38]。 通過轉基因技術對這些相關基因序列進行操控可獲得相關PD 轉基因動物模型，拓寬模型種類。 該轉基因模型具體分為SNCA(α-突觸核蛋白，PARK1 和4)，PRKN(parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase，PARK2)，PINK1(PTEN-induced putative kinase 1，PARK6)，DJ-1(PARK7)和LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2，PARK8)[39-40]。 且在這些動物模型中，SNCA 模型最為常見，使用最為廣泛。 雖然在這些轉基因模型中很少觀察到黑質、紋狀體等區(qū)域的神經損傷，但其為研究PD 的病理變化和發(fā)病機理，以及從基因分子水平揭示PD 發(fā)病機制提供了研究基礎。

2.1 α-突觸核蛋白

α-突觸核蛋白是一種可溶性小蛋白，主要在中樞神經突觸前與核周附近表達[41]。 其參與膜蛋白與囊泡調節(jié)的動態(tài)平衡。 研究發(fā)現該蛋白相關基因在家族遺傳性PD 中起主導作用，稱為PARK1 基因。 有關家族遺傳性PD 的研究發(fā)現，該基因突變會導致家族遺傳性PD；并且，只有該基因發(fā)生點突變或3 個以上的位點突變時，發(fā)生PD 疾病的概率將顯著增加[42-43]。 該轉基因動物模型會產生類PD運動癥狀，但有關黑質、紋狀體內的神經損傷癥狀尚未見報到。

2.2 Parkin

Parkin 是泛素連接酶的一種，由PRKN 基因編碼。 研究發(fā)現該酶失活會導致家族性與散發(fā)性PD，且患者普遍具有早發(fā)性[44]。 現有研究已經明確了超過200 個Parkin 相關基因與PD 具有顯著相關性，且大多為隱形遺傳，其遺傳率不論是在純合子生物還是雜合子生物中均高達100%[45]。 其具體作用機制為：該類基因功能障礙導致線粒體內蛋白表達紊亂，造成線粒體功能受損，引發(fā)線粒體功能障礙。 敲除Parkin 相關基因的動物模型是最早使用的PD 轉基因動物模型之一[46]。 最新研究表明，激活Parkin 相關基因，可改善線粒體功能，恢復PD 運動癥狀，或可治療PD 疾病。 此外，Parkin 相關基因過度表達會保護黑質免受其他神經毒素作用，如6-OHDA、病變突觸核蛋白等。 這一發(fā)現或為PD 治療提供新的思路。

2.3 PINK1

PINK1 是線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，與線粒體功能穩(wěn)定性密切相關。 約有4% ～9%的亞洲人群和2% ～4%的白種人的早發(fā)性PD 由該基因突變所致[47]。 該基因在感受線粒體相關膜電位、激活Parkin 酶活性，促進損傷線粒體降解中發(fā)揮了重要作用[48]。 研究發(fā)現，PINK1 基因突變會導致常染色體隱形PD 發(fā)生。 該基因動物模型通常不表現出典型的PD 病變—突觸核蛋白沉積。 而這一現象與患者剖檢結果一致[49]。 此外，PINK1 基因敲除小鼠還會表現出嗅覺和步態(tài)障礙，與PD 患者的前驅癥狀相似。 因此，PINK1 敲除模型可用于研究前驅階段的PD[50]。

2.4 DJ-1

DJ-1 基因編碼的蛋白作用廣泛，可參與基因轉錄調節(jié)、氧化應激、線粒體功能調節(jié)等活動[51]。 該基因突變會造成氧化應激反應功能紊亂，導致常染色體隱形PD[52]。 其具體作用機制目前尚未研究清晰，該模型多用于PD 基礎研究。 不同動物類型的該基因敲除模型具有顯著差異。 小鼠模型通常表現出中度運動障礙，且未見多巴胺能神經元壞死[53]，而大鼠模型通常會表現為黑質紋狀體區(qū)域神經元壞死、缺失，并伴有運動功能障礙的臨床癥狀[54]。

3 轉基因與神經毒素聯用模型

最新研究發(fā)現，上述轉基因動物更容易受到神經毒素的作用，使造模效果更為顯著。 例如，將MTPT 作用于DJ-1 缺失小鼠后，其神經元壞死、缺失更為顯著，并且該模型或可為Dual-hit 假說提供新的證據[55]。 將魚藤酮長期作用于α-突觸核蛋白轉基因小鼠可觀察到PD 經典三聯征，即進行性運動障礙、黑質紋狀體變性與α-突觸核蛋白過表達。在α-突觸核蛋白基因敲除PD 嚙齒動物模型中注射6-OHDA 后，表現出黑質紋狀體內大量多巴胺能神經元持續(xù)缺失與漸進性損傷，但不誘導α-突觸核蛋白過表達，可研究神經性物質與PD 相關基因之間的相互作用關系[56]。 在雙側黑質紋狀體內過表達α-突觸核蛋白的小鼠體內給予亞急性MPTP 后，可觀察到黑質紋狀體對MPTP 的敏感性顯著增加。因此，通過聯用模型，使得研究PD 相關基因與神經毒素間的相互作用成為可能[57]。 不僅如此，聯用模型還可以使我們更加全面地了解PD 疾病所導致線粒體的具體損傷過程，展示PD 相關基因與機體的相互作用，了解外界環(huán)境是如何誘發(fā)PD 疾病。 因此，轉基因與神經毒素聯用模型在研究PD 疾病作用機制中具有重要作用。

4 動物類型

PD 動物模型使用動物種類廣泛、多樣。 按其具體分類，可大致分為四類，包括嚙齒類、靈長類、其他哺乳動物(小型豬、狗、貓)和其他動物(秀麗隱桿線蟲(C. elegans)、果蠅、斑馬魚)。 嚙齒類動物在神經毒素模型中使用最為廣泛，是經典的造模動物種類。 其優(yōu)點主要為：(1)大小適中，其解剖結構與臨床癥狀與PD 病人最為相似。 (2)飼養(yǎng)條件簡單，成本較低[58]。 (3)操作最為簡單，倫理問題較少。 而轉基因動物最常使用其他動物，包括秀麗隱桿線蟲、果蠅等生物。 其主要原因是由于這類動物結構簡單，基因組信息較易獲得，且生命周期較短。靈長類動物在PD 研究中使用較早，其優(yōu)缺點分明，且該類動物在每次實驗中使用數量較少。 其優(yōu)點主要是該類動物與人類進化親緣性最高，實驗結果最為接近，但缺點是飼養(yǎng)、操作復雜，成本較高，且使用數量局限，涉及倫理問題較多。

5 總結

在PD 眾多動物模型中，神經毒性模型使用最多，范圍最廣。 其優(yōu)勢主要在于其操作簡單，成本較低，結果重復性較好。 其他兩類模型使用范圍相對較小，但縱觀現有研究可以發(fā)現，這兩類PD 動物模型的使用呈增加趨勢。 這3 類動物模型具有各自鮮明的特點，其均從不同的角度解釋了PD 的發(fā)生機制，如何根據研究內容去選擇具體種類的PD 動物模型就顯得尤為重要。 同時，雖然這些PD 動物模型從不同角度、不同作用機制模擬PD 的發(fā)生，但不可否認的是，PD 患者所表現出的病變與癥狀與動物模型所反映的仍存在現實差異，因此，我們應該著眼于具體研究所使用的PD 動物模型的有效性與結果的可重復性。 與此同時，如何通過新興研究技術，使PD 動物模型最大程度貼合PD 患者的臨床癥狀就是我們研究的主要目標。 這里我們具體展示了不同種類的PD 動物模型的各自特點并羅列了其與PD 患者所存在的具體差異(詳見表1)。 最新研究技術諸如CRISPER/CAS9 與光遺傳推動了PD的研究進展[59-60]，但是，這些新模型的有效性還需要在后續(xù)研究中進一步驗證。

當然，除了本文中所討論的PD 動物模型外，在相關研究中還存在其他一些PD 動物模型。 例如突觸核蛋白沉積模型。 其具體做法為：將含有病變突觸核蛋白的腦勻漿注射到實驗動物體內，制造PD動物模型。 雖然通過類似操作獲得的PD 動物模型還未得到研究者們的普遍認同，但這些動物模型在研究PD 中確實發(fā)揮了重要作用。 因此，這再一次體現了確認PD 動物模型有效性與可重復性的重要性。

表1 不同類型PD 動物模型的特征分析及與PD 患者的差異比較Table 1 Summary and difference of the main models of PD