卜寶英 顧鑫亮 宣鵬飛 武敏 徐喜媛 楊敬平

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,包頭014010;2包鋼三醫(yī)院急診科,包頭014010

膿毒癥是機體對感染產(chǎn)生的失調(diào)的免疫反應(yīng),導(dǎo)致多系統(tǒng)及器官功能障礙的綜合征[1]。膿毒癥病死率高,明確其病理生理學(xué)機制是降低病死率的關(guān)鍵[2-3]。膿毒癥發(fā)病機制尚不明確,研究表明膿毒癥導(dǎo)致的失調(diào)的免疫反應(yīng)包括固有免疫和獲得性免疫,與遺傳及基因變異有密切關(guān)聯(lián)[1,4]。研究表明80%的非洲人種存在Caspase-12 基因多態(tài)性,其中Caspase-12L等位基因可減少脂多糖誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生[5-6]。Saleh 等[7]發(fā)現(xiàn)Caspase-12 作為顯性負調(diào)節(jié)因子,可抑制了IL-1β、IL-18等產(chǎn)生。本研究通過檢測膿毒癥患者Caspase-12 基因多態(tài)性及Caspase-12表達,了解其在膿毒癥發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2016年2月至2018年5月符合社區(qū)獲得性肺炎,同時符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]入住內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的膿毒癥患者共34例為膿毒癥組,其中男20例,女14例;年齡(57.3±15.2)歲。選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢中心22名健康體檢者為對照組,其中男13名,女9名;年齡(56.5±13.5)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫抑制;前8周內(nèi)接受過化療;年齡＞80歲;肝腎功能衰竭患者。2組的年齡、性別比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05)。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn) (2015MER-024),受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取受試者入院第一天外周靜脈血,-80 ℃凍存,批量檢測。

1.2.2 外周血基因組DNA 提取 外周血基因組DNA 使用TransDirect TMAnimal Tissue PCR Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取;全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),檢測DNA 濃度,選取濃度≥0.1 g/L,純度1.7～1.9的DNA 為實驗樣品。

1.2.3 PCR 基因擴增采用PCR 儀 (美國ABI公司)進行,依據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心SNP 數(shù) 據(jù) 庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)查詢基因序列,使用primer 5.0引物設(shè)計軟件對Caspase-12的T125C 位點進行引物設(shè)計進行PCR 擴增,檢測Caspase-12的T125C多 態(tài) 性。 引 物 序 列： 正 向 引 物 5'-GTCATTCTGTGTGTATTAATTGC-3';反向引物5'-CCTATAATATCATACATCTTGCTC-3'。使用TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技 (北京)有限公司,目錄號DP209]純化PCR 產(chǎn)物,在2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳 (100 V,50 A,30 min),以DNA MarkerⅠ為分子量標(biāo)準(zhǔn),在紫外顯色下觀察、攝影。

1.2.4 基因測序 最終將純化的PCR 產(chǎn)物提取20μl,并附T125C 正向引物、反向引物10μl由北京華大基因公司行基因測序。

1.2.5 熒光定量PCR 總RNA 提取后反轉(zhuǎn)錄總RNA,進行熒光定量PCR,用primer 5軟件設(shè)計PCR 引物如下。

表1 Caspase-12熒光定量PCR 的引物序列

在熒光定量PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進行檢測,用ΔCT 法計算結(jié)果,公式為：平均相對含量=未知樣品的相對含量÷對照樣品的相對含量=2-平均ΔcT。其中,ΔCT 未知樣品=CT 未知樣品-CT 內(nèi)參。用SYBR GREEN I染料法對正常對照組及膿毒癥組進行Caspase-12定量PCR 檢測,以GAPDH、β-Actin cDNA 模 版 作 為 參 考,檢 測Caspase-12的表達量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測 首先新鮮抗凝血經(jīng)洗滌后取得所需淋巴細胞后裂解,煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。目的蛋白樣品按照順序在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠上點樣,電泳結(jié)束后用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜,封閉、孵育一抗及二抗。PVDF膜在顯色液中孵育,壓片、曝光、顯影并定影,掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。定量資料以x-±s表示。采用正態(tài)分布參數(shù)的單因素方差分析和異常分布參數(shù)的秩和檢驗,對兩組連續(xù)變量進行比較。采用最小顯著性差異檢驗比較3組間的差異。此外,利用遺傳頻率檢驗對哈迪-溫伯格平衡進行評價。使用χ2測試組進行分析基因型分布的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴增 從膿毒癥患者提取外周血基因組DNA,再設(shè)計特異引物并進行PCR 反應(yīng)后獲得電泳圖譜 (圖1)。純化后產(chǎn)物的大小在300 bp附近,與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 Caspase-12基因的表達圖譜

2.2 目的片段的基因測序 將純化的PCR 產(chǎn)物進行測序,結(jié)果未見Caspase-12的T125C 位點的基因突變(圖3～4)。

2.3 RT-PCR 檢 測Caspase-12 m RNA 表 達 血Caspase-12 m RNA 對照組及膿毒癥組分別為0.52±0.27及1.59±0.84,膿毒癥組明顯高于對照組(t=6.441,P＜0.000 1),見圖5。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-12前體蛋白的表達結(jié)果 膿毒癥組及對照組的Caspase-12 前體蛋白灰度值分別為0.81±0.28、0.56±0.18,膿毒癥組明顯高于對照組 (t=4.62,P＜0.000 1),見圖6。

圖2 Caspase-12基因的表達純化后電泳圖譜

圖3 Caspase-12的基因峰圖

2.5 Caspase-12 m RNA 表達水平與Caspase-12前體蛋白表達的相關(guān)性及對膿毒癥的預(yù)測價值 經(jīng)Pearson相關(guān)分析,入院第一天外周血Caspase-12 m RNA 表達水平與Caspase-12前體蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.70,P＜0.001),見圖7。

入院第一天外周血Caspase-12 m RNA 與Caspase-12前體蛋白表達水平的曲線下面積分別為0.901和0.719,Caspase-12 m RNA 表達水平與Caspase-12前體蛋白表達對膿毒癥的診斷有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均＜0.05)。其中,以Caspase-12 m RNA 表達水平0.907為截斷點,診斷的敏感度78.0%、特異度89.9%;以0.578為截斷點,診斷的敏感度65.2%,特異度70.4% (圖8)。

3 討論

膿毒癥是呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)面臨的最為常見且需要緊急處理的臨床問題。膿毒癥起始階段發(fā)生強烈的促炎反應(yīng),形成失控性過度炎癥反應(yīng),以后出現(xiàn)抗炎或免疫抑制狀態(tài),導(dǎo)致感染播散,出現(xiàn)血流動力學(xué)異常及器官功能障礙[1-3]。目前,膿毒血癥的發(fā)病率、病死率明顯偏高,但尚無有效的特異性及靶向治療及特異性預(yù)警方法[1-3]。膿毒癥發(fā)病與多基因調(diào)控有關(guān),許多與內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的受體存在基因多態(tài)性,與免疫系統(tǒng)對病原微生物的清除能力相關(guān)。膿毒癥的特異基因變化,可能為特異性的生物標(biāo)記及靶向治療提供依據(jù)[4-6]。炎癥細胞因子介導(dǎo)的膿毒癥與Caspase家族介導(dǎo)的免疫細胞凋亡及免疫抑制相關(guān),尤其對固有免疫反應(yīng)的作用更為重要[5-8]。人類Caspase-12 位于染色體11q22.3,具有調(diào)節(jié)炎性細胞因子及炎癥反應(yīng)的作用[5-7],如Caspase-12L 具有減少促炎反應(yīng),增強抑制炎癥反應(yīng)的作用,導(dǎo)致感染持續(xù)及嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)生[5-6]。但Chen等[6]的研究發(fā)現(xiàn)非裔人群中,Caspase-12L等位基因的存在與社區(qū)獲得性肺炎的易感性、病死率及嚴(yán)重性無關(guān)。Wang等[8]報道在西尼羅河病毒感染中,Caspase-12具有正向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的作用,表明其對免疫反應(yīng)也有正向調(diào)節(jié)作用。本實驗檢測了膿毒癥患者靜脈血中Caspase-12 m RNA 及Caspase-12前體蛋白的表達,結(jié)果顯示膿毒癥患者外周血中Caspase-12 m RNA 及前體蛋白均高表達且Caspase-12 mRNA 表達水平與Caspase-12前體蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.49,P＜0.001),表明Caspase-12 參與了膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程,與前述報道相似[5-8]。Caspase-12 的基因多態(tài)性在不同種族具有明顯差異,對Caspase-12第125位氨基酸基因測序結(jié)果表明：160例亞洲人及187例高加索人均為T125純合子;而776例非裔血統(tǒng)T125 純合子比例為79.8%,T125/T125C雜合子比例18.6%[9]。本研究結(jié)果中,膿毒癥患者Caspase-12基因測序結(jié)果未見T125C 位點的基因突變,本研究與非洲人種中攜帶Caspase-12L等位基因的頻率有較大差別,與上述報道相似[5-6,9]。但本試驗樣本量有限,需進一步增加樣本量進行驗證。Caspase-12的基因多態(tài)性對膿毒癥的不同作用可能與細菌感染的種類及性別相關(guān)[9-11]。Caspase-12對免疫反應(yīng)的正向或反向調(diào)節(jié)有待于進一步研究。

圖4 Caspase-12 (T125C)基因測序結(jié)果

圖5 各組外周血Caspase-12 m RNA 的表達

圖6 對照組和膿毒癥組外周血樣中Caspase-12前體蛋白表達

膿毒癥早期預(yù)警對降低病死率有重要意義。本研究表明,入院第一天Caspase-12 m RNA 表達水平與Caspase-12 前體蛋白表達的曲線下面積為0.901和0.719,對膿毒癥的診斷有顯著意義(P＜0.001,P=0.002)。以Caspase-12 m RNA 表達水平0.907為截斷點,診斷膿毒癥的敏感度78.0%、特異度89.9%;前體Caspase-12蛋白以0.578為截斷點,診斷膿毒癥的敏感度65.2%,特異度70.4%。Caspase-12 m RNA 及前體蛋白可能成為潛在的預(yù)警指標(biāo),對膿毒癥診斷、評估、治療提供重要的生物學(xué)標(biāo)記。

圖7 入院第一天2 組外周血Caspase-12 m RNA 與Caspase-12前體蛋白表達的相關(guān)性

圖8 Caspase-12 mRNA 及Caspase-12前體蛋白的受試者工作特征曲線

本研究未見膿毒癥患者Caspase-12 基因T125C位點的基因突變,應(yīng)該進一步擴大樣本量,并研究其他種族,如蒙古族等的相應(yīng)基因及不同位點的多態(tài)性,將有助于不同區(qū)域?qū)δ摱景Y發(fā)病機制、診斷及治療提供新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突