張久明， 劉亦丹， 張一雯， 遲鳳琴*， 魏 丹， 周寶庫，宿慶瑞， 匡恩俊， 郝小雨， 孫 磊

1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料與環(huán)境資源研究所， 黑龍江省土壤環(huán)境與植物營養(yǎng)重點實驗室， 黑龍江 哈爾濱 150086 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院博士后科研工作站， 黑龍江 哈爾濱 150086 3. 北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所， 北京 100097 4. 東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院， 黑龍江 哈爾濱 150030

引 言

土壤腐殖質是土壤有機質的重要組成部分， 作為養(yǎng)分源主要是C源和N源， 在土壤肥力， 環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要作用。 土壤腐殖物質三組分即胡敏酸(HA)、 富里酸(FA)和胡敏素(Hu)， 其中Hu是與無機礦物緊密結合、 任何pH條件的水溶液中都不溶解的腐殖物質組分[1]。 Hu占有土壤有機碳含量的50%以上[2]， 在腐殖質中是重要的組成部分， 不論是維持土壤結構、 保持土壤養(yǎng)分， 還是調節(jié)土壤的營養(yǎng)元素循環(huán)， 對營養(yǎng)元素固持和有效性， 以及在土壤肥力和生態(tài)環(huán)境等方面起著重要作用。 差熱分析是熱分析中最成熟和應用最廣泛的技術， 它是一種在程序控制溫度下， 測量樣品與參比物之間溫度差與溫度關系的方法[3]。 隨著現(xiàn)代儀器分析方法及手段的發(fā)展，13C-核磁共振(13C-NMR)波譜、 紅外光譜、 熒光光譜等分析技術更多的運用到腐殖質結構的分析[4-5]。 以農(nóng)業(yè)部黑龍江耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學觀測試驗站為平臺(39年黑土定位施肥試驗)， 結合差熱分析、 傅里葉變換紅外光譜、 核磁共振波譜現(xiàn)代分析技術手段， 從物質結構的角度對比分析黑土長期定位試驗典型施肥處理土壤Hu分子結構變化特征， 為黑土長期培肥提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試驗地點基本情況

黑土肥力長期定位監(jiān)測試驗站1979年建立， 位于中國黑龍江省哈爾濱市(E126°51′28″， N45°50′37″)， 海拔151 m， 屬松花江二級階地。 土壤為發(fā)育于黃土狀母質上的中層黑土， 黑土層厚度為50 cm， 質地為壤質。 氣候屬中溫帶大陸性季風氣候， ≥10 ℃年平均有效積溫2 700 ℃， 年降雨533 mm， 無霜期135 d。 試驗站共24個處理， 本研究選取其中CK， NPK， M和MNPK四個施肥處理， 3次重復， 每個小區(qū)面積36 m2， 1979年定位試驗之前種植作物為小麥， 基本養(yǎng)分性狀見表1。 長期定位試驗采用小麥(1980年)-大豆-玉米輪作方式， 在不同作物年份施肥用量見表2。 有機肥為純馬糞， 按純氮量75 kg·hm-2(約馬糞18 600 kg·hm-2)施用， 每輪作周期玉米收獲后施入。 馬糞中有機碳(C)、 氮(N)、 磷(P2O5)和鉀(K2O)含量分別為163.6， 5.8， 6.5和9.0 g·kg-1。 氮、 磷、 鉀肥均為秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施， 50%于大喇叭口期追肥)， 氮肥為尿素(N 46%)， 磷肥為重過磷酸鈣(P2O546%)， 鉀肥為硫酸鉀(K2O 50%)。

表1 供試土壤基本性質(1979年)

注： 1979年9月采集土樣測定結果

Note: Results of soil samples collected in September 1979

注： CK表示不施肥； NPK表示施氮磷鉀化肥； M表示施有機肥； MNPK表示有機肥配施氮磷鉀化肥(下同)

Note: CK means no fertilization; NPK means nitrogen, phosphorus and potassium fertilizers applied; M means organic fertilizer applied; MNPK means organic fertilizer with nitrogen, phosphorus and potassium fertilizers applied (the same below)

1.2 土壤樣品采集

選取長期定位試驗對照不施肥(CK)， 有機肥(M)， 無機肥氮磷鉀配施(NPK)， 有機肥與無機肥氮磷鉀配施(MNPK)。 土壤樣品采集于2012年秋(玉米)， 采用S型取樣， 共取5點， 采集深度為0～20 cm。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤Hu的提取與純化

稱取過0.25 mm的風干土樣10 g于100 mL離心管中， 加80 mL蒸餾水提取24 h離心后棄去上清液， 上述方法進行2次。 向離心管中加入80 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液， 24 h后離心得到腐殖質(HE， 可用于提取FA和HA)， 重復此方法直至提取液顏色很淺為止。 離心管中的殘渣依次用體積比為0.5%， 2.5%， 5%， 10%， 20%， 30%和40%的HCl-HF混合液分別處理7， 7， 11， 6， 4， 2和1次， 每次間隔12 h。 如經(jīng)過以上步驟處理后還有沙粒沒有洗凈， 可適當用20%的混合酸再洗幾次， 最后用蒸餾水洗至無Cl-反應(AgNO3檢驗)， 再經(jīng)冷凍干燥， 得到純Hu[5]。

1.3.2 測試及分析儀器

(1)固體有機碳采用總有機碳分析儀(TOC)測定。

(2)紅外光譜(IR)分析應用美國NICOLET-EZ360紅外光譜儀， 掃描范圍為4 000～400 cm-1， 采用KBr壓片法測定。 將待測有機質樣品經(jīng)真空冷凍干燥后， 粉碎研細到小于2 μm， 然后分別用微量或半微量天平稱取土壤有機質樣品和KBr粉末， 并以樣品∶KBr=1∶200的比例， 在瑪瑙研缽中混磨后壓片。 以4 000， 2 000和860 cm- 1處作為零吸收點， 將通過3點的直線作為基線， 進行吸收強度的測定， 并加以比較。 測定時， 儀器的分辨率設為4 cm-1。

(3)熱性質分析采用日本島津TA-60型差熱分析儀測定， 并應用儀器自帶軟件對各樣品進行差熱分析(differential thermal analysis， DTA)和熱重分析(thermogravimetric analysis， TG或TGA)；

(4)固態(tài)13C核磁共振波譜采用瑞士BrukerAV400型核磁共振儀測定， 運用交叉極化魔角自旋(CPMAS)技術，13C 共振頻率為400.18 MHz， 魔角自旋頻率為8 kHz， 接觸時間為2 ms， 循環(huán)延遲時間為3 s， 數(shù)據(jù)點為3 000個， 化學位移用外標2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸鈉(DSS)校正， 積分面積由儀器自動給出， 各類型碳相對含量用某化學位移區(qū)間積分面積占總積分面積的百分數(shù)表示。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

紅外光譜分析采用Nicolet Omnic 8.0專業(yè)軟件， 核磁共振波譜(CPMAS13C-NMR)采用MestRe Nova專業(yè)軟件分析。 經(jīng)過分析提取源數(shù)據(jù)后采用Microsoft Office Excel 2010和Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖， Origin繪圖將“Available Data”中數(shù)據(jù)以擬合曲線疊加方式進行繪制， SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(鄧肯法)相關分析。

2 結果與討論

2.1 長期施肥下黑土腐殖質組分Hu碳及有機碳含量

結果表明(表3)， MNPK， M和NPK施肥處理土壤有機碳含量為14.79， 14.50和14.39 g·kg-1， 較CK處理分別提高19.2%， 16.8%和16.0%， 各施肥處理與CK差異顯著(p<0.05)。 表明無論是有機無機肥配施還是單施有機肥和單施化肥較不施肥處理均提高土壤有機碳含量， 但以有機無機肥配施增加效果最為顯著。 黑土不同施肥措施使土壤Hu的含量在處理間的高低變化有所不同， 各處理的土壤Hu平均含量大小順序為NPK>CK>M>MNPK， 處理之間差異不顯著(p<0.05)。 土壤Hu占有機碳的比值顯示， 各施肥處理均較CK處理下降， 其中MNPK施肥處理最低， NPK施肥處理高于施有機肥處理。

表3 不同施肥處理黑土Hu碳及有機碳含量

Table 3 Hu carbon and organic carbon content in black soil under different fertilization treatments

年份/土層處理Hu碳提取量/(g·kg-1)有機碳/(g·kg-1)占有機碳/%CK6.65±0.4a12.41±0.11b53.592012年NPK6.88±0.3a14.39±0.12a47.81(2012)M6.64±0.4a14.50±0.20a45.79MNPK6.35±0.3a14.79±0.18a42.93

注： 不同小寫字母表示不同施肥處理間差異顯著(p<0.05)(下同)

Note: different lower-case letters indicate significant differences among different fertilization treatments (p<0.05) (the same below)

2.2 長期施肥下黑土胡敏素的熱性質分析

土壤Hu的差熱分析DTA曲線顯示： 黑土不同施肥處理都出現(xiàn)低溫吸熱峰， 中溫和高溫放熱峰。 低溫吸熱峰出現(xiàn)在65 ℃， 中溫放熱峰在340～345 ℃之間， 高溫放熱峰在485～515 ℃之間。 MNPK和NPK施肥處理土壤Hu的中溫放熱峰溫較高為345 ℃， 高溫放熱峰溫M處理最高為515 ℃， 其次CK處理為500 ℃。

圖1 不同施肥處理黑土Hu的DTA曲線

從半定量積分數(shù)據(jù)的結果(表4)來看， 不同施肥處理土壤腐殖質組分Hu反應熱存在一定的差異。 M， NPK和MNPK施肥處理較CK處理總反應熱增加， 較CK處理分別提高9.7%， 2.1%和0.6%， 因此可以初步說明M和NPK施肥處理中土壤Hu能夠分解的有機質含量較高。 中溫放熱值代表土壤Hu脂肪族結構含量的高低， M， MNPK和NPK施肥處理較CK均有不同程度增加， M施肥處理增加最多， 提高27.9%， 其次是MNPK施肥處理提高6.7%； 各施肥處理高溫/中溫值大小為NPK>CK>MNPK>M， 代表NPK和CK處理土壤腐殖質組分Hu分子中的芳香結構較多。

表4 不同施肥處理黑土Hu的反應熱

2.3 長期施肥下黑土Hu的FTIR特征

從表5可看到： 與CK處理相比， 2 920/1 620其比值的高低順序為MNPK>M>CK> NPK， 表明單施有機肥和有機無機肥配施均可提高土壤Hu的2 920/1 620比值， 其脂族性增強， 芳香性減弱。 不同施肥處理土壤Hu的2 920/2 850值的高低順序為M>NPK>MNPK>CK， 表明施肥可以增加土壤Hu分子中脂族鏈烴的比例， 單施有機肥增加比例最高。

2.4 長期施肥作用下黑土胡敏素的CPMAS 13C-NMR波譜特征

圖3為Hu的固態(tài)CPMAS13C-NMR波譜， 可劃分為四個主要的共振區(qū)， 即烷基C區(qū)(0～50 ppm)、 烷氧C區(qū)(50～110 ppm)、 芳香C區(qū)(110～160 ppm)和羰基C區(qū)(160～200 ppm)[6]。 年際間不同施肥處理中黑土Hu的烷基C吸收峰主要在29～30 ppm最為明顯， 是長鏈烷烴或環(huán)烷烴結構中的亞甲基C。 Hu的烷氧C吸收峰主要在73 ppm附近， 歸屬為碳水化合物C的吸收。 芳香C區(qū)中， 128～132 ppm主要是苯環(huán)基碳C， 單寧和木質素； 羰基C區(qū)中， 主要信號出現(xiàn)在170～172 ppm， 為酯和酰胺C的吸收[7]。

圖2 不同施肥處理黑土Hu紅外光譜

表5 不同施肥處理黑土Hu的IR光譜主要吸收峰的相對強度/cm-1(半定量)

注： 2 920/1 620比值為2 920+2 850處面積與1 620處面積的比值； 2 920/2 850比值為2 920處面積與2 850處面積的比值

Note: the value of 2 920/1 620 is the ratio of (2 920+2 850) area to 1 620 area; the value of 2 920/2 850 is the ratio of 2 920 area to 2 850 area

圖3 不同施肥處理黑土腐殖質組分Hu的CPMAS 13C-NMR波譜

Fig.3 CPMAS13C-NMR spectra of humus fractions Hu from black soil under different fertilization treatments

烷氧碳主要來源于半纖維素、 纖維素、 聚合和非聚合的碳水化合物或類乙醇物質， 代表易被微生物代謝利用的碳水化合物， 即易分解碳。 通常烷基C/烷氧C比值是評價土壤有機碳分解程度的敏感指標， 可用來反映腐殖物質烷基化程度的高低， 其比值越小說明有機質的分解程度越低。 芳香碳主要來源于木質素、 軟木質、 多肽類或黑碳等帶有苯環(huán)類的物質， 也可能來源于微生物代謝產(chǎn)物或植物體經(jīng)過高熱產(chǎn)生的物質， 它常和烷基碳一起， 用來表征難被微生物利用的碳化合物， 即難分解碳。 為了更簡明闡述土壤Hu的結構變化， 將各類型C的比值進行分析， 結果表明(表6)， 不同施肥處理較CK土壤Hu的烷基碳/烷氧C比值均增加， NPK施肥處理提高30.3%， 幅度最大。 各施肥處理中土壤Hu的疏水C/親水C比值MNPK施肥處理提高6.6%， 幅度最大； NPK施肥處理土壤Hu的疏水C/親水C比值較CK降低。 施入有機肥處理明顯增加土壤Hu的疏水C/親水C比值， 以MNPK施肥處理最高， NPK施肥處理最低， 差異顯著。 說明有機無機肥配施可以提高土壤有機碳穩(wěn)定性， 而單施化肥處理有機質分解程度增加， 穩(wěn)定性較CK降低。

表6 不同施肥處理黑土Hu的固態(tài)CPMAS13C-NMR不同類型C分布

Table 6 Solid state CPMAS13C-NMR C distribution in black soil Hu under different fertilization treatments

處理烷基C/烷氧C疏水C/親水C2012年CK0.76±0.01b1.51±0.05cNPK0.99±0.05a1.49±0.12cM0.94±0.02a1.55±0.09bMNPK0.89±0.03b1.61±0.11a

注： 疏水C/親水C=(烷基C+芳香C)/(烷氧C+羧基C)

Note: Hydrophobic C/hydrophilic C=(alkyl C+aromatic C)/(alkoxy C+carboxyl C)

3 結 論

以往學者對土壤腐殖質組分結構的研究從單一的方法， 逐漸向多種光譜學技術的聯(lián)合應用進行發(fā)展， 隨著現(xiàn)代儀器分析方法及手段的運用，13C-核磁共振(13C-NMR)波譜、 紅外光譜、 熒光光譜等分析技術更多的運用到腐殖質結構的分析當中[8]。 土壤腐殖質的研究更多的是關注土壤和水污染修復[9-10]， 以及分析不同類型土壤或某一時間不同施肥方式對土壤腐殖質組分含量和組分結構的變化， 但系統(tǒng)輪作條件下長期施肥后腐殖質Hu組分含量和結構變化規(guī)律研究較少。

熱性質分析可以表征土壤Hu可分解有機質含量多少， 本研究結果顯示， M和NPK施肥處理中土壤Hu能夠分解的有機質含量較高。 紅外光譜可以定性分析其脂族性強弱， 結果顯示M和MNPK處理均可提高土壤Hu的2 920/1 620比值， 其脂族性增強， 芳香性減弱。13C核磁共振波譜可以半定量分析其各類型碳含量， 結果顯示有機無機肥配施可以提高土壤有機碳穩(wěn)定性， 而單施化肥處理有機質分解程度增加， 穩(wěn)定性較CK降低。 雖然不同施肥方式可以增加土壤Hu碳含量， 但占土壤總有機碳比重降低。 表明土壤總有機碳增加是由于土壤腐殖質不同組分相互累加而導致， 不是受土壤腐殖質單一組分變化決定。

本研究表明有機無機肥配施可以最大程度提升土壤碳庫容量， 土壤Hu的脂族性增強， 提高土壤有機碳穩(wěn)定性， 并同時證明多種光譜學技術的聯(lián)合應用可以更加準確的反應腐殖質組分結構的變化特征。