趙怡錕， 于燕波， 申兵輝， 楊勇琴， 艾俊民， 嚴(yán)衍祿， 康定明*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 北京 100094 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院， 北京 100094 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院， 北京 100094

引 言

作物品種真實(shí)性的鑒定， 傳統(tǒng)上多用表型鑒定和當(dāng)下廣為應(yīng)用的DNA或蛋白質(zhì)分子鑒定。 然而， 這兩種方法不僅耗時(shí)費(fèi)力， 對環(huán)境也有污染[1-3]。 而近紅外光譜檢測具有快速、 無損樣品、 環(huán)境友好的特點(diǎn)， 已應(yīng)用于多種作物種子的品種真實(shí)性鑒定， 以及種子營養(yǎng)成分含量的檢測[4-6]。 楊傳得等利用近紅外反射光譜檢測花生種子含水量， 模型決定系數(shù)(R2)為0.936 2[7]。 王傳梁等用近紅外漫反射光譜分析大米籽粒的脂肪含量， 決定系數(shù)為0.988 9[8]。 張初等基于反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了近紅外光譜對于西瓜種子品種真實(shí)性的鑒定[9]。 但近紅外光譜檢測因易受過程處理和環(huán)境的影響， 光譜信號(hào)波動(dòng)大， 檢測結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性較差， 在歸類判別類型的定性檢測中應(yīng)用受到極大限制。 同一種子批隨著時(shí)間的推移， 其光譜會(huì)產(chǎn)生變化， 因此某一時(shí)間建立的模型對其他時(shí)間所采集的光譜的鑒別率會(huì)下降， 最終導(dǎo)致模型的穩(wěn)定性下降； 但目前我國對近紅外光譜分析模型穩(wěn)定性的研究不多， 影響該項(xiàng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。

玉米是主要糧食作物之一， 玉米種子真實(shí)性的檢測鑒定， 在良種培育、 種子生產(chǎn)和經(jīng)營中需要頻繁進(jìn)行。 目前玉米自交系和雜交種子的真實(shí)性鑒定， 種子生產(chǎn)和經(jīng)營中常采用特征同工酶聚丙烯酰胺蛋白電泳凝膠譜帶技術(shù)[10]， 以及通過DNA特征位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增來鑒定識(shí)別品種真實(shí)性[11-12]， 但上述方法技術(shù)復(fù)雜， 成本較高， 耗時(shí)長， 不能進(jìn)行實(shí)時(shí)在線分析。 近紅外光譜技術(shù)可以用于玉米真實(shí)性鑒定。 唐興田等利用仿生模式識(shí)別建模， 進(jìn)行了玉米品種真實(shí)性鑒定， 平均正確識(shí)別率和平均正確拒識(shí)率達(dá)到94.5%和96.71%。 但還不能對非建模時(shí)間段采集的樣品進(jìn)行預(yù)測， 對不同存儲(chǔ)時(shí)間下玉米種子的預(yù)測也沒有研究， 不同種子存儲(chǔ)時(shí)間帶來的模型不穩(wěn)定性問題沒有解決。

為此， 我們將近紅外光譜檢測技術(shù)用于玉米品種真實(shí)性鑒定， 選用10個(gè)相同地點(diǎn)和相同時(shí)間生產(chǎn)的玉米雜交種及自交系的種子， 研究玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間的長短對近紅外光譜檢測結(jié)果可重復(fù)性和穩(wěn)定性的影響， 進(jìn)而通過一年間不同時(shí)段的對相同種子批樣品的持續(xù)光譜采集， 最后針對采集到的所有近紅外光譜數(shù)據(jù)， 進(jìn)行聯(lián)合建模， 由此來判別分析下一年度采集相同樣品的光譜檢測結(jié)果， 用模型對檢測樣品的正確鑒別率來分析玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間對模型預(yù)測結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與光譜采集

玉米種子為收獲于2015年產(chǎn)自甘肅張掖的玉米雜交種和自交系種子， 共12個(gè)品種， 1440份樣品。 10個(gè)品種作為實(shí)驗(yàn)組， 2個(gè)作為對照組， 對照組將作為非標(biāo)準(zhǔn)樣品摻入建模集， 參與真實(shí)性建模， 其中4CV-C72作為雜交品種非標(biāo)樣， 鄭58作為自交系非標(biāo)樣， 詳細(xì)信息見表1。

表1 12個(gè)品種詳細(xì)信息

近紅外光譜數(shù)據(jù)采集采用MicroNIR 1700近紅外微型光譜儀， 數(shù)據(jù)分析軟件為Matlab?(Mathworks, Inc, U.S.)。

所有收獲的樣品在室內(nèi)通過均勻干燥， 再加濕的方法， 使樣品水分處于10%～11%， 密封后， 平衡水分1周。 樣品篩選， 每個(gè)品種挑選籽粒完整， 顏色一致的種子120粒。 光譜采集前， 光譜儀需預(yù)熱45 min， 之后進(jìn)行單籽粒光譜數(shù)據(jù)采集。 采集方式為漫反射， 積分時(shí)間為10 000 μs， 積分次數(shù)為400次， 采集時(shí)間4秒， 在每粒種子胚面位置采集光譜3次， 取平均值， 每組種子采集完光譜， 單粒種子逐一做標(biāo)記， 室溫通風(fēng)處存放。

為使1年中采集的光譜數(shù)據(jù)時(shí)間相隔均勻， 以月為單位， 1年分為12個(gè)采集光譜時(shí)間段， 每月采集4次， 分別在每月4， 11， 18和25日上午(9點(diǎn)—11點(diǎn))， 下午(14點(diǎn)—16點(diǎn)),晚上(19點(diǎn)—21點(diǎn))3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行， 以此作為每月的光譜數(shù)據(jù)。 每天的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)品種采集10條光譜， 1天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)， 每天合計(jì)30條光譜， 每月120條光譜。

1.2 方法

對原始光譜進(jìn)行平滑預(yù)處理(平滑窗口長度為9)， 消除噪聲干擾， 然后使用一階差分導(dǎo)數(shù)(差分寬度為9)放大差別， 消除基線和其他背景干擾， 分辨重疊峰， 提高分辨率和靈敏度， 最后用矢量歸一化降低同一品種玉米籽粒光譜若干次采集間的差別。

在上述預(yù)處理的基礎(chǔ)上， 采用PLS-DA建立品種真實(shí)性鑒別模型， 以月為單位， 從每品種單月采集的120條光譜中選取前90條作為建模集， 用于建立預(yù)測模型， 后30條作為測試集。 即JK968的建模集由2016年1月采集的90條JK968與90條4CV-C72光譜組成， 測試集由2月采集的30條JK968與30條4CV-C72光譜組成， 以此類推， 其他各品種建模集和預(yù)測集相同方法建立。

本研究用正確鑒別率(correct identification rate， CIR)來評(píng)價(jià)模型性能， 其計(jì)算方式為： (模型正確鑒別樣品個(gè)數(shù)+模型正確拒識(shí)樣品個(gè)數(shù))/參與測試樣品總數(shù)。 最終通過主成分分析以及模型正確鑒別率來綜合分析玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間對近紅外光譜分析結(jié)果的影響程度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間的種子真實(shí)性鑒定結(jié)果

為了探究玉米籽粒存儲(chǔ)時(shí)間對玉米品種真實(shí)性的近紅外光譜單籽粒預(yù)測模型穩(wěn)定性的影響， 利用1月份光譜數(shù)據(jù)建立品種真實(shí)性鑒定模型(單月建模)， 分別鑒定2到12月的相同品種， 結(jié)果如圖1所示， 縱坐標(biāo)表示1月份建立的單月模型對2到12月每月測試集鑒定的正確鑒別率， 結(jié)果顯示， 正確鑒定率均呈逐月下降的趨勢， 其中， J724的正確鑒別率由98.33%下降至63.33%， 下降較明顯。 同時(shí)， 同一品種的同一種子批， 由儲(chǔ)藏開始建立的品種真實(shí)性鑒定模型已無法對儲(chǔ)藏11個(gè)月后的該種子批進(jìn)行高準(zhǔn)確度的鑒定(所有樣品1月份單月模型對12月測試集鑒定的正確鑒別率均在83.33%以下)。 這說明玉米種子的存儲(chǔ)時(shí)間越長將降低應(yīng)用近紅外光譜鑒定品種真實(shí)性的鑒定準(zhǔn)確度。

圖1 基于1月份單月所建模型對2月至12月測試集的鑒別結(jié)果

2.2 玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間變化導(dǎo)致光譜數(shù)據(jù)離散

為研究模型隨玉米種子樣品存儲(chǔ)時(shí)間的變長， 鑒定結(jié)果不穩(wěn)定的原因， 用10個(gè)品種的2016年1月到12月的光譜數(shù)據(jù)來剖析， 隨著玉米種子儲(chǔ)存時(shí)間的推移， 樣品光譜數(shù)據(jù)的變化。

以雜交種JK968， 自交系6WC為例， 圖2為JK968與6WC的原始光譜經(jīng)過預(yù)處理后， 通過主成分分析將光譜數(shù)據(jù)降維后得到的2維圖( 圖中“□”表示1月份光譜數(shù)據(jù)， “○”表示6月份光譜數(shù)據(jù)， “△”表示12月份光譜數(shù)據(jù))， 由圖可見， 不管是JK968或是6WC， 玉米種子不同存儲(chǔ)時(shí)間樣品的光譜呈現(xiàn)不同程度的離散， 1月份和6月份JK968的光譜數(shù)據(jù)在特征空間中有部分重疊， 而12月份的光譜數(shù)據(jù)與1月份的相對距離較遠(yuǎn)， 幾乎在空間內(nèi)分開， 說明無論是雜交種還是自交系， 應(yīng)用近紅外光譜進(jìn)行玉米種子真實(shí)性單籽粒鑒定時(shí)， 同一品種樣品的光譜數(shù)據(jù)會(huì)隨著玉米種子樣品的存儲(chǔ)時(shí)間推移產(chǎn)生離散變化， 在玉米種子樣品存儲(chǔ)11個(gè)月后， 這種離散變化更加顯著， 重復(fù)性一致性越低， 使得玉米種子的真實(shí)性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性越低。

2.3 擴(kuò)充模型包容性， 增加鑒定結(jié)果穩(wěn)定性

同一種子批在1年的不同時(shí)段月份采集的光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生變化， 即延長玉米種子的儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)導(dǎo)致模型的正確鑒別率下降。 針對上述問題， 用擴(kuò)充模型的包容性來消除因建模數(shù)據(jù)與檢測樣品數(shù)據(jù)時(shí)間跨度較大對近紅外光譜檢測玉米種子品種真實(shí)性鑒定的影響。 用穩(wěn)定性(也稱容變性)來評(píng)價(jià)玉米種子品種真實(shí)性鑒定的近紅外光譜模型， 模型的穩(wěn)定性指模型適配范圍的大小， 主要決定于建模光譜集中不確定信息(背景信息)變動(dòng)的范圍。

圖2 1月， 6月， 12月預(yù)處理后光譜數(shù)據(jù)PCA分析結(jié)果

背景信息是檢測樣品存儲(chǔ)時(shí)間變量所帶來的， 隨著玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間的延長， 存儲(chǔ)環(huán)境變化的溫度、 濕度， 空氣中水分等外界因素都可能會(huì)引發(fā)玉米種子內(nèi)部有機(jī)物含量的變化， 而由此干擾不同時(shí)間段采集到的近紅外光譜的一致性， 從而使得在這些光譜數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上建立的模型的穩(wěn)定性。 我們通過擴(kuò)充建模集中受干擾的信息的范圍， 即將1年內(nèi)在不同時(shí)間段里， 也即在不同環(huán)境因素、 儀器因素及種子樣品等變化因素下采集到的光譜數(shù)據(jù)， 均擴(kuò)充到建模光譜數(shù)據(jù)中， 以增加根據(jù)擴(kuò)充數(shù)據(jù)建立的近紅外光譜預(yù)測模型的包容性。

包容性模型的具體建立方法， 以JK968為例， 如表2所示， 模型編號(hào)1-2表示1月與2月建模集聯(lián)合后建立的包容性模型(聯(lián)合建模)， 之后分別對2016年3月—12月測試集的樣品進(jìn)行鑒定， 之后逐月增加建模集光譜數(shù)據(jù)， 并對非建模集所在月份進(jìn)行逐月鑒定， 例如， 1—11表示將1月至11月的建模集進(jìn)行聯(lián)合建模， 對12月測試集進(jìn)行鑒定。 可以看出， 模型1-2至1-5整體呈現(xiàn)出圖4相同的趨勢， 即模型對建模集相鄰月份的測試準(zhǔn)確度較高， 之后逐月降低。 當(dāng)建模集內(nèi)加入1月—6月份建模集內(nèi)的特征光譜后， 包容性模型的平均正確鑒別率可穩(wěn)定在92%以上。

通過以上方式， 對10個(gè)玉米品種進(jìn)行了測試， 結(jié)果見表3， ACIR(單月建模)表示1月單獨(dú)建模分別鑒定2月—12月測試集的正確鑒別率平均值， ACIR(聯(lián)合建模)表示所有包容性模型對其非建模所在月份測試集鑒定后正確鑒別率的平均值， 可以看出， 包容性模型的平均正確鑒別率相較于單月模型均有明顯提高， 其中J92與XY211的平均正確鑒別率分別提高11.58%與7.71%。

表3 聯(lián)合建模的平均正確鑒別率

表4 基于2016整年聯(lián)合建模的模型對于2017年測試集鑒別結(jié)果

Table 4 Identification results of cross-modeling by dataset of 2016 whole year， data collected in 2017 for test(Unit： %)

樣品名稱平均正確鑒別率樣品名稱平均正確鑒別率FH1096.994CV90.50JK96892.866WC93.02LD1689.54C7297.17XY21196.30J9297.63YY597.72J72496.82平均值94.68平均值95.03

總的看來， 為使近紅外光譜的玉米種子真實(shí)性單粒鑒定的正確鑒別率進(jìn)一步提高， 將2016年整年采集的光譜數(shù)據(jù)均加入到包容性模型的建模集中， 并對模型進(jìn)行為期一整年的測試， 測試集為2017年1月—12月采集的光譜， 測試結(jié)果見表4， 表中所示平均正確鑒別率為2016年包容性模型對樣品2017年每個(gè)月測試集鑒定后的正確鑒別率平均值。 可以看出， 除了LD16的平均正確鑒別率為89.54%， 其他樣品均在90%以上， 另外， 玉米雜交種全年的平均正確鑒別率為94.68%， 自交系為95.03%， 10個(gè)玉米品種的平均正確鑒別率為94.86%。

3 結(jié) 論

以同一產(chǎn)地， 同一收獲時(shí)間的10個(gè)玉米品種為對象， 研究玉米種子的存儲(chǔ)時(shí)間對近紅外光譜玉米種子品種真實(shí)性單籽粒鑒定的影響程度。 結(jié)果表明: 種子存儲(chǔ)時(shí)間的延長會(huì)直接降低近紅外光譜對玉米種子品種真實(shí)性單籽粒鑒定的正確鑒別率。 故此， 提出了擴(kuò)充模型的包容性， 來解決玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間變量對模型穩(wěn)定性的影響。 通過聯(lián)合建模， 包容性模型較于單月模型的正確鑒別率明顯提高。 同時(shí)， 為進(jìn)一步提高模型的正確鑒別率， 將2016年整年的光譜數(shù)據(jù)均加入包容性模型的建模集中， 提高模型應(yīng)對光譜采集時(shí)間、 環(huán)境等可能不一致條件的應(yīng)變能力， 增強(qiáng)模型的穩(wěn)定性， 使測試集玉米雜交種2017年的平均正確鑒別率達(dá)到94.68%， 自交系達(dá)到95.03%， 為進(jìn)一步研發(fā)專用模型和實(shí)用設(shè)備提供基礎(chǔ)。

對于玉米種子存儲(chǔ)時(shí)間的延長所導(dǎo)致的光譜變化的具體原因， 將在后續(xù)研究結(jié)果中報(bào)道， 以期對進(jìn)一步提高近紅外光譜玉米種子單籽粒品種真實(shí)性鑒定模型的正確鑒別率有指導(dǎo)意義。